副溶血性弧菌分离株毒力相关基因分布特征及脉冲场凝胶电泳分型

论文摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐菌,是我国沿海地区引发食源性疾病的重要病原菌,能引起散发性和地方流行性的胃肠炎暴发。副溶血性弧菌在我国沿海地区和部分内陆地区引发食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势,已高居微生物性食物中毒首位。致病性副溶血弧菌能够产生耐热性直接溶血素（TDH）、TDH相关溶血素（TRH）,或两者均产生。该菌不仅通过海产品而且通过淡水产品及其他食物进行流行传播。尽管目前该菌的致病机理还不清楚,但是一些公认的与毒力相关的基因已被证实。且由于传统的生化分型和血清学分型不能有效的进行同源性分析,而基于DNA结构研究的PFGE方法在微生物鉴定中具有很好的分型力、分辨力、可重复性、可比性、灵敏性。因此本研究系统地调查了中国大陆的副溶血性弧菌,特别是高致病性菌株毒力相关基因的分布情况,并对分离株的耐药谱特征进行分析；同时应用脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）对不同来源的副溶血性弧菌分离株进行分子分型研究,以了解中国大陆副溶血性弧菌分离株的PFGE遗传谱系分布以及菌株间的同源性,并结合毒力相关基因的结果,分析分离株的毒力特征,以期为制定防治副溶血性弧菌导致食源性疾病策略提供预警、监测和控制依据。研究中,首先对2008～2010年分离自上海、浙江、福建、广东、江苏的233株副溶血性弧菌分离株进行毒力相关基因的检测,结果显示：223株分离株中,致病株（tdh+或trh+）有118株,占总菌数的52.9%,其中tdh基因携带率为48.9%,trh携带率为4.0%；高致病性菌株（tdh+和toxRS/new+）94株,占总菌数的42.2%；orf8、MTase.HU-α和VP2905在所有菌株中的概率分别为42.6%、43.0%、41.7%和43.0%。临床分离株中检出高致病株和致病株的概率要显著高于食品分离株。在94株高致病株中,orf8、MTase.HU-α和VP2905的阳性率分别为97.8%、97.8%、96.8%和96.8%,表明orf8、MTase.HU-α和VP2905可作为高致病株的独特基因。对来自江苏、浙江和上海的177份人源株和139株食源株的耐药性分析显示,在7种抗生素中,对氨苄青霉素（AM）、链霉素（SM）和卡那霉素（KM）的耐药率分别为57%、40.5%和25.3%,而对诺氟沙星（NOR）、氯霉素（CM）、复方新诺明（SXT）和四环素（TE）的耐药率仅分别为0.3%、0.3%、0.9%和1.6%,结果表明副溶血弧菌菌株的耐药性不严重。177株人源株对四环素、卡那霉素和氨苄青霉素的耐药率要高于食源株,而对链霉素、诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素的耐药率要低于食源株。高致病株、致病株和非致病株均对链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素出现较高的耐药率,且对三种抗生素耐药性程度不同。高致病株对多数治疗致病性弧菌感染的药物敏感,耐药现象不严重；与国际上认为高致病株具有相同的耐药谱且对氨苄青霉素全部耐药不同,本研究的高致病株对氨苄青霉素只是多数耐药,耐药率为58.4%。对141株江苏、上海、浙江、福建和广东的副溶血性弧菌分离株进行PFGE研究,结果显示可分型菌株数为119株,分型率为84.4%。经PFGE电泳获得108种带型,所得的PFGE图谱分为五种遗传谱系：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ,各谱系所含菌株比率分别为14.3%、25.2%、15.1%、13.4%和31.9%,表明中国大陆的副溶血性弧菌分离株主要分布在谱系Ⅱ和Ⅴ中。不同地区分离株的PFGE分析结果显示,扬州分离株集中在Ⅱ和Ⅴ,浙江分离株集中在Ⅰ中,其余地区分离株的分布相对集中,均有各自的优势谱系。不同分离时间的PFGE分析结果显示,2006、2007、2008、2009和2010年分离株分别主要分布在谱系Ⅳ、Ⅴ、Ⅴ、Ⅰ和Ⅲ中,各年代的分离株均有各自的主要谱系。不同源分离株的PFGE分析结果显示,人源株主要分布在谱系Ⅱ和Ⅴ,食品分离株相对集中在谱系Ⅴ。这些结果说明中国大陆副溶血性弧菌分离株的分离地区、分离时间及不同宿主源与PFGE遗传谱系有一定的相关性。不同遗传谱系分离株对7种抗生素的耐药性分析显示,各谱系不存在对氯霉素、复方新诺明和诺氟沙星耐药的菌株,对四环素耐药的菌株仅分布在谱系Ⅰ和Ⅱ中,对链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素耐药的菌株分布较均衡,无显著性差异,说明PFGE谱系与耐药性无明显相关性。分子分型研究表明,PFGE可作为研究副溶血性弧菌传播途径、分子流行病学及溯源的有力工具。对扬州地区分离株的PFGE分析结果表明,9组细菌的PFGE带型相同,遗传系数为100%,部分菌株之间同源性很高（>80%）,提示在食品的销售、消费、运输等过程中,该菌可通过水平传播、交叉污染的方式向人类传播,引发食源性疾病。不同PFGE副溶血性弧菌的毒力相关基因分析表明,中国大陆的副溶血性弧菌高致病株、致病株及非致病株都有各自独特的谱系,高致病株主要存在于谱系Ⅰ和Ⅴ中；两种致病株（tdh阳性株和trh阳性株）分布规律不同,其中tdh阳性致病株主要分布在谱系Ⅰ中,trh阳性致病株主要分布在Ⅱ和Ⅲ中；非致病株主要分布在谱系Ⅳ中,分布呈现明显的差异性,且携带orf8、MTase、（?）HU-α和VP2905基因的菌株的PFGE谱系分布规律与高致病株一致,进一步说明了orf8、MTase、HU-α和VP2905是高致病株的标记基因。PFGE与MLST分型的比较分析显示,两种分型方法具有高度的一致性,PFGE可作为该菌分子分型的金标准,分辨率高于MLST。高致病株的原始序列型ST-3以及CC3复合体的其他成员只分布在谱系Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ中,谱系Ⅱ和Ⅴ是高致病株的优势谱系。大多数高致病株的PFGE型别是一致的,且高致病株的始祖菌的PFGE谱系与高致病株的PFGE带型相同或谱系相同。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 第一章 综述副溶血性弧菌分型技术研究进展
• 1 副溶血性弧菌表型分型技术
• 1.1 副溶血性弧菌血清学分型
• 1.2 副溶血性弧菌噬菌体分型
• 2 副溶血性弧菌分子分型技术
• 2.1 基于基因扩增的分型方法
• 2.2 基于核酸测序的分型方法
• 2.3 基于限制性内切酶的分型方法
• 3 结语
• 参考文献
• 第二章 副溶血性弧菌分离株毒力相关基因分布特征及脉冲场凝胶电泳分型
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 副溶血性弧菌毒力相关基因检测
• 2.2 副溶血性弧菌耐药性分析
• 2.3 副溶血性弧菌分离株的PFGE分析
• 2.4 不同PFGE副溶血性弧菌的毒力相关基因分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表的学术论文