利用酵母双杂交技术筛选与BmDNV-Z病毒蛋白互作的家蚕中肠细胞蛋白

论文摘要

病毒感染可以造成重要经济昆虫家蚕大量死亡。其中,家蚕浓核病毒（Bombyx mori densonucleosis virus, BmDNV）是引起家蚕浓核病症的关键病原体。BmDNV具有很强的宿主特异性,通常只感染家蚕幼虫中肠组织的柱状细胞,进而引起家蚕大量死亡。在我国的家蚕资源库中,大多数家蚕品系对BmDNV敏感,只有少数家蚕品系对BmDNV表现抗性。酵母双杂交是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的技术。为了更好的理解家蚕对BmDNV-Z的抗性机制,本研究利用酵母双杂交技术,筛选BmDNV-Z病毒与家蚕中肠细胞之间的互作蛋白。我们用构建完成的家蚕浓核病毒基因组所含的七个编码框的诱饵表达载体转化酵母Saccharomyces cerevisiae Y187的菌株,分别筛选家蚕幼虫中肠酵母双杂交文库,结果得到十二个与家蚕浓核病毒中国株之间有相互作用的宿主蛋白,包括Bombyx mori 35kDa protease、hypothetical protein、Bombyx mori ribosomal protein S5、Bombyx mori transgelin、Bombyx mori serine protease precursor。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 家蚕浓核病毒中国株
• 1.2 昆虫对病毒的免疫
• 1.3 酵母双杂交系统
• 第二章 研究内容和方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 工具酶及试剂盒
• 2.2.3 其它材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 氯化钙制备新鲜的感受态细胞
• 2.3.2 质粒DNA转化
• 2.3.3 质粒DNA的小量制备
• 2.3.4 连接反应
• 2.3.5 胶回收DNA片段
• 2.3.6 酵母菌感受态制备（LiAc法）
• 2.3.7 酵母菌的保存和复苏
• 2.3.8 构建家蚕浓核病毒中国株基因组所含的七个编码框的诱饵表达载体并转化酵母Y187
• 2.3.8.1 引物设计及PCR反应
• 2.3.8.2 BmDNV-Z诱饵载体的构建
• 2.3.8.3 重组诱饵载体转化酵母菌
• 2.3.8.3.1 验证AH109和Y187酵母菌营养表型
• 2.3.8.3.2 诱饵载体自激活检测
• 2.3.8.3.3 诱饵载体毒性的检测
• 2.3.8.3.4 诱饵载体转化酵母菌
• 2.3.8.3.5 检测转化效率
• 2.3.9 将转化有诱饵质粒的酵母Y187菌株与家蚕中肠cDNA文库进行杂交
• 2.3.9.1 两种酵母菌株杂交
• 2.3.9.2 涂布平板并计算杂交效率
• 2.3.10 筛选杂合体并进行测序
• 2.3.10.1 表现型的重复检测
• 2.3.10.2 菌落PCR验证
• 2.3.10.3 筛到的基因连接T载体
• 第三章 实验结果
• 3.1 构建家蚕浓核病毒中国株基因组所含的七个编码框的诱饵表达载体并转化酵母Y187的实验结果
• 3.1.1 PCR扩增结果
• 3.1.2 诱饵载体构建
• 3.1.3 BmDNV-Z诱饵表达载体转化酵母菌
• 3.1.3.1 AH109和Y187酵母菌营养表型的验证
• 3.1.3.2 诱饵载体自激活检测
• 3.1.3.3 诱饵载体毒性的检测
• 3.1.3.4 转化效率的计算
• 3.2 将转化有诱饵质粒的酵母Y187菌株与家蚕中肠cDNA文库进行杂交的结果
• 3.3 筛选杂合体并进行测序的实验结果
• 3.3.1 表现型的重复检测
• 3.3.2 菌落PCR结果
• 3.3.3 测序结果
• 第四章 讨论
• 本研究的创新点
• 参考文献
• 致谢