中国梅丛枝菌根真菌多样性研究

论文摘要

梅是中国特产的著名果树和花木,是我国自然状况下最早开花的木本花卉,栽培与应用历史悠久,野生分布于我国南方十五省（区）,引种栽培几乎遍及中国大部分地区。本项目研究梅形成共生菌根的丛枝菌根真菌（AMF）多样性,通过采集主要野生分布区和栽培区的梅根系和根际土壤,应用染色镜检法测定根系的侵染、形态学方法鉴定丛枝菌根真菌种类、分子生物学方法检测丛枝菌根真菌居群多样性,研究结果探清梅共生菌根的类型、AMF菌根真菌种类、生态分布等规律和特点,取得一系列的创新性研究成果,对于梅的栽培、花果品质改良、生理与生态学研究都有着重要的理论与实践意义。主要研究结果如下:1、本研究首次确定梅的丛枝类型为疆南星型（Arum-type）,无隔胞间菌丝直径2～12μm,泡囊形状多种、以椭圆形为多、直径10～120μm,侵入菌丝有单菌丝、多菌丝、匍匐菌丝等形式。以直径小于0.5mm的细根测定侵染率,其值为8.39～32.22%,不同地域取样的根系AM侵染率呈极显著差异;在不同季节中,春季的梅根系AM侵染率、侵入点、泡囊和丛枝均高于其它季节的。2、根据孢子形态特征鉴定,从梅根际土壤中分离得到AMF种类99个种,分属于11属,属数占世界属总数的81.8%;鉴定种类89个,种数占全世界已知种总数的43.0%;其它还有10个为未描述种。其中拟定新种2个（梅花球囊霉Glomus mume和刺环孢囊霉Kuklospora spinosa）、中国新记录种20个,而且环孢囊霉属Kuklospora、类球囊霉属Paraglomus和内生球囊霉属Intraspora为中国首次报道的三个属,极大地丰富了中国AMF种质资源,这是我国报道AMF资源种类最多的一次。3、从11个采样地点分离得到AMF 99种,其中G.claroideum和G.geosporum在所有采样地点均有分布,属于广分布种;G.mosseae和G.rubiforme 2个种在10个采样地点中有分布,分布较广;有39个AMF种仅在1个采样地点中分离得到,占总种数量的39.4%,分布在1-2个采样地的AMF种类累计为63种,占总数的63.6%,这些种均是分布区域较狭窄的种类。4、野梅根际土壤中AMF种类为32-38种/样地,而栽培梅园分离得到的AMF种类为19-25种/样地。梅自然分布中心--藏、川、滇的根际土壤中AMF多样性指数分别为2.68、2.62、2.53,是研究区域中最高的三位。根据AMF多样性指数、孢子密度、种丰度、种数、属数进行聚类分析,可划分为四类。5、在所调查的范围内,梅根际土壤的AMF多样性指数（H）随海拔上升而增多、随经度升高而降低;孢子密度（SD）也是随着海拔上升而增多、野生梅土壤的孢子密度明显高于栽培梅的;种丰度（SR）在黄壤、棕壤、红壤、黑壤中递增,随着有机质、全氮、有机氮的增多而升高。通径分析表明,对梅根际土壤AMF孢子密度、种丰度和多样性指数起直接效应的只有经度（x1）、纬度（x2）、海拔（x3）、pH（x4）、全磷（x5）、有机磷（x6）、有机氮（x7）等7个因素,根据这7个因素的效应,可建立多元线性回归方程:H=50.085-0.025 x1+0.006 x2+0.0000515 x3-0.031 x4+0.18 x5+0.0000562 x6SD=5710.333+0.342x1-70.884x2+0.088x3-170.629x4-1080.973x5-0.602x6-0-158x7SR=-300.776+00.299x1-0.131 x2+0.002 x3+0.754 x4+00.934 x5-0.01 x6+0.011 x76、在极端生态条件下,梅根际土壤的AMF群落表示出一定的特异性。贵州喀斯特地区的AMF种类以具孢子果的小孢子种类相对较多、西藏林芝地区以无梗囊霉属的种类居多。7、北京地区在四个季节中,梅根际土壤的AMF种类:春季17种,夏季16种,冬季12种,秋季为10种、最少;多样性指数:秋季>夏季>春季>冬季;各个季节的根际土壤AMF种的差异较大,春季与夏季的种相似性系数最大为0.42,而冬季和秋季的种相似性系数最低仅为0.27。从武汉梅园的春、秋季AMF群落组成变化和藏东南地区野梅的花、果期AMF群落组成变化来看,春季（花期）的AMF多样性指数高于夏季（果期）或秋季。8、以武汉春季采取的梅根际土壤和根系样品,通过nested PCR的AFLP分子标记分析,得知土壤的AMF基因组DNA多态性位点为6.5个,明显多于根系内的3个位点。其中土壤的AMF基因组DNA多态性位点数与孢子形态鉴定的种类数量基本吻合。根据AFLP标记结果聚类,梅品种根系内AMF基因组DNA的聚类类别与梅品种的“品种群”这一分类级别无相关关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 丛枝菌根的国内外研究概况与进展
• 1.1.1 菌根的定义与类型
• 1.1.2 丛枝菌根（AM）真菌的分类学进展
• 1.1.3 生态学进展
• 1.1.4 分子生物学进展
• 1.1.5 应用与其它方面
• 1.1.6 我国在丛枝菌根真菌的研究进展
• 1.2 本项目研究目的和意义
• 1.2.1 立项依据
• 1.2.2 研究内容与意义
• 1.2.3 实施方案与技术路线
• 2 梅丛枝菌根侵染的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品采集与处理
• 2.1.2 AM菌根侵染率测定
• 2.1.3 数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 梅根系的AM结构
• 2.2.2 梅不同粗度根系的AM侵染情况
• 2.2.3 不同地方梅根系的AM侵染差异
• 2.2.4 不同季节梅根系的AM侵染差异
• 2.3 结论与讨论
• 3 梅丛枝菌根真菌的分类研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 土壤样品采集
• 3.1.2 AM真菌孢子的分离、鉴定、贮藏
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 球囊霉目Glomerales的种类
• 3.2.1.1 球囊霉科Glomeralceae
• 3.2.2 多孢囊霉目Diversisporales的种类
• 3.2.2.1 巨孢囊霉科Gigasporaceae
• 3.2.2.2 无梗囊霉科Acaulosporaceae
• 3.2.2.3 内养囊霉科Entrophosporaceae
• 3.2.2.4 和平囊霉科Padsporaceae
• 3.2.2.5 多孢囊霉科Diversisporaceae
• 3.2.3 类球囊霉目Paraglomerales的种类
• 3.2.4 原囊霉目Archaeosporales的种类
• 3.2.4.1 地管囊霉科Geosiphonaceae
• 3.2.4.2 原囊霉科Archaeosporaceae
• 3.2.4.3 两性囊霉科Ambisporaceae
• 3.2.5 梅根际土壤中AMF各属种类占世界已知种类的比例
• 3.3 结论与讨论
• 4 中国梅丛枝菌根真菌的生态研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 土壤样品采集
• 4.1.2 AM真菌孢子的分离和鉴定
• 4.1.3 土壤理化性质的测定
• 4.1.3.1 土壤PH的测定
• 4.1.3.2 土壤有机质含量的测定
• 4.1.3.3 土壤全氮量的测定
• 4.1.3.4 土壤有机磷的测定
• 4.1.3.5 土壤有机钾的测定
• 4.1.3.6 土壤全磷的测定
• 4.1.4 数据分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 中国主要野梅分布区和梅栽培区的AMF种类
• 4.2.2 北京地区梅根际丛枝菌根真菌群落的四季变化规律
• 4.2.2.1 实验地的自然概况与采样的梅品种
• 4.2.2.2 四季土壤中的AMF群落组成
• 4.2.2.3 四季土壤中AMF种类的相似性
• 4.2.2.4 四季土壤中AMF种类特征系数与土理化性质的关系
• 4.2.3 武汉梅园春、秋季梅的根际丛枝菌根真菌群落的变化规律
• 4.2.3.1 武汉梅园的自然概况与梅的年生育节律
• 4.2.3.2 春、秋季的根际丛枝菌根真菌群落组成
• 4.2.4 藏东南地区野梅花、果期的根际丛枝菌根真菌群落的变化规律
• 4.2.4.1 藏东南地区野梅林自然概况与野梅种类特征
• 4.2.4.2 花、果期的根际丛枝菌根真菌群落组成
• 4.2.5 贵州喀斯特地区野梅根际丛枝菌根真菌群落特点
• 4.2.5.1 贵州喀斯特地区的自然概况与土壤理化性质
• 4.2.5.2 根际丛枝菌根真菌群落组成与特点
• 4.2.5.3 根际丛枝菌根真菌与土壤理化性质相关性
• 4.2.6 生态因子对梅根际丛枝菌根真菌群落的影响
• 4.2.6.1 生态因子与根际AMF的孢子密度、种丰度和多样性指数的相关关系
• 4.2.6.2 根际AMF的孢子密度、种丰度和多样性指数与相关生态因子的回归分析
• 4.2.6.3 根际AMF的孢子密度、种丰度和多样性指数与生态因子的通径分析
• 4.2.6.4 中国主要野梅分布区和梅栽培区的AMF聚类分析
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 不同季节梅根际土壤中AMF的变化特点
• 4.3.2 生态因子对梅根际土壤AMF的影响
• 4.3.3 土壤理化性质对梅根际土壤AMF的影响
• 5 梅根际土壤与根系内的AMF分子多样性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 样品
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 改良CTAB法提取根内基因组DNA
• 5.1.4 土壤微生物总DNA的提取与纯化
• 5.1.5 DNA检测
• 5.1.6 AMF基因片段的Nested PCR扩增
• 5.1.6.1 Nested PCR引物
• 5.1.6.2 PCR反应体系及条件
• 5.1.6.3 PCR产物纯化
• 5.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 5.1.7.1 酶切
• 5.1.7.2 人工接头的连接
• 5.1.7.3 扩增
• 5.1.7.4 扩增产物的聚丙烯酰胺的凝胶电泳
• 5.1.7.4.1 配制电泳所需溶液
• 5.1.7.4.2 聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 5.1.7.4.3 电泳
• 5.1.7.4.4 银染
• 5.1.7.4.5 胶板的后处理
• 5.1.8 AFLP扩增数据处理的分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 根系内总DNA的的提取、PCR扩增和扩增产物纯化的结果
• 5.2.2 根际土壤微生物总DNA的提取、PCR扩增和扩增产物纯化的结果
• 5.2.3 根系内和根际土壤中的AMF基因组DNA的AFLP指纹图谱分析
• 5.2.4 根系内AMF基因组DNA遗传相似性与聚类图谱
• 5.2.5 根际土壤AMF基因组DNA遗传相似性与聚类图谱
• 5.2.6 梅相同品种的根系内与根际土壤AMF基因组DNA AFLP分析
• 5.3 结论与讨论
• 6 总结与讨论
• 6.1 总结
• 6.2 问题与讨论
• 6.2.1 根系AM侵染与植物生长节律的关系
• 6.2.2 土壤理化性质对梅根际土壤AMF的影响
• 6.2.3 AMF的形态鉴定与其它分类方法的关系
• 6.2.4 根际土壤AMF种类与植物根系侵染AMF的关系
• 参考文献
• 个人简历
• 博士研究生期间发表的论文、完成及在研的科研课题
• 导师简介
• 致谢