枯草芽孢杆菌WL17抗菌物质的分离制备及抗菌特性研究

论文摘要

枯草芽孢杆菌产生的抗菌类物质具有较广的抗菌谱,对酸、碱、高温等都具有很高的耐性,本身为小分子肽类物质,无毒副作用,因此将其作为一种天然防腐剂运用到食品工业中具有很大的发展潜力。本文对枯草芽孢杆菌抗菌物质的发酵生产、分离纯化、抗菌机理及其保鲜应用等进行了研究,主要内容如下：枯草芽孢杆菌发酵条件的优化研究。先采用Plackett-Burman设计法从6个影响发酵生产的因素中筛选出三个关键因素：初始pH、装液量、碳氮比。利用响应曲面法确定上述3个因子的最佳水平为初始pH 6.91、装液量47.59ml/250ml、碳氮比2.22,抗菌活性类物质抑菌圈直径的大小从未优化前的16.8mm提高到了23.14mm。抗菌物质抗菌活性和稳定性的研究。抗菌物质对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）等食品病原菌具有显著的抑菌作用；对pH、温度以及胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感,但在高温、强酸或强碱的共同作用下,抗菌物质的抑菌能力显著降低；抗菌物质在不同能量的脉冲强光照射下,稳定性没有发生显著变化。抗菌物质的抑菌机理研究表明,抗菌物质对大肠杆菌具有显著的抑制作用,其最低抑菌浓度为0.614mg/ml。在大肠杆菌生长不同时期加入抗菌物质均能取得很好的抑制效果。二乙酸荧光素染色法和Fluo3/AM荧光探针法分析表明抗菌物质能够增大大肠杆菌细胞膜的通透性,同时通过扫描电镜和透射电镜观察到经抗菌物质处理后的细胞表面粗糙,边缘模糊,细胞膜破裂。采用Sephadex LH-20柱和液相制备色谱对抗菌物质进行分离纯化。经SephadexLH-20柱层析分离后得到四个分离级分,其中级分4具有显著的抗菌活性。对级分4进行液相分离制备,可获得三个具有显著抗菌活性的组分,ESI-MS分析表明,级分4除含有三种fengycin的同系物和两种surfactin同系物外,还含有一些新的抗菌化合物。研究了枯草芽孢杆菌WL17抗菌物质添加浓度以及与脉冲强光的联合应用对鱼丸贮藏过程中菌落数、TBA值、TVB-N值、硬度、弹性和咀嚼性的影响。结果表明当抗菌物质添加量为2mg/g时,可使菌落数下降1.23个数量数级,TBA值和TVB-N值都处于较低水平,鱼丸的质构特性也没有大的变化。抗菌物质与脉冲强光之间具有协同增效作用,当添加浓度为2mg/g,脉冲闪照能量为2.7j/cm2时保鲜效果最显著。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 枯草芽孢杆菌代谢活性物质的种类和特点
• 1.1 非核糖体途径合成的抗菌物质
• 1.1.1 表面活性素（surfactin）
• 1.1.2 伊枯草菌素（Iturin）
• 1.1.3 芬枯草菌素（Fengycin）
• 1.1.4 多肽类抗菌物质
• 1.2 核糖体途径合成的抗菌物质
• 1.2.1 细菌素
• 1.2.2 蛋白类抗菌物质
• 1.2.3 活性酶类抗菌物质
• 2 抗菌肽类物质的分离纯化及其鉴定技术
• 2.1 抗菌肽的分离纯化技术
• 2.2 抗菌肽的定性检测方法
• 2.2.1 薄层原位酸水解-茚三酮显色法
• 2.2.2 水显色法
• 3 抗菌肽的生物活性和抗菌机理研究
• 3.1 抗菌肽的生物活性及测定方法
• 3.2 抗菌肽的作用机理
• 3.2.1 膜结合型抗菌机制
• 3.2.2 非膜结合型抗菌机理
• 4 本课题研究的意义、目的和内容
• 4.1 本课题研究的意义和目的
• 4.2 本课题的研究内容
• 第二章 枯草芽孢杆菌WL17产抗菌物质的发酵条件优化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 1.1.1 菌株和培养基
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 种子液的制备
• 1.2.2 抗菌粗提物的制备
• 1.2.3 抗菌物质活性的测定
• 1.2.4 菌体细胞生长与抗菌物质合成的关系研究
• 1.3 试验设计
• 1.3.1 Plackett-Burman实验筛选影响抗菌物质合成的关键因素
• 1.3.2 最陡爬坡实验研究关键影响因素的最优水平区域
• 1.3.3 Box-Behnken实验设计确定关键因素的最优水平
• 2 结果与分析
• 2.1 菌体细胞生长与抗菌物质合成关系
• 2.2 抗菌物质合成的关键影响因素的确定
• 2.3 响应面法优化抗菌物质的发酵条件
• 2.3.1 响应曲面模型的建立及回归分析检验
• 2.3.2 发酵条件的响应面分析及条件优化
• 3 本章小结
• 第三章 枯草芽孢杆菌WL17产抗菌物质稳定性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂和仪器
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 枯草芽孢杆菌WL17抗菌物质的制备
• 1.2.2 抗菌物质对食品常见致病菌和腐败真菌抑菌能力的测定
• 1.2.3 抗菌物质的稳定性分析
• 1.3 数据统计分析
• 2 结果分析
• 2.1 抗菌物质对食品致病菌和腐败菌的抑制作用
• 2.2 抗菌物质的稳定性分析
• 2.2.1 酸碱性对抗菌物质稳定性影响的结果分析
• 2.2.2 温度对抗菌物质稳定性影响的结果分析
• 2.2.3 温度与pH对抗菌物质稳定性影响结果分析
• 2.2.4 不同能量脉冲强光处理对抗菌物质稳定性影响的结果分析
• 2.2.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶对抗菌物质稳定性的影响
• 3 本章小结
• 第四章 枯草芽孢杆菌WL17产抗菌物质抑菌机理的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 1.1.1 实验菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 枯草芽孢杆菌WL17抗菌活性物质的制备
• 1.2.2 抗菌物质最小抑菌浓度的测定
• 1.2.3 抗菌物质对大肠杆菌生长曲线的影晌
• 1.2.4 抗菌物质对大肠杆菌细胞通透性的影晌
• 1.2.5 抗菌物质对大肠杆菌细胞显微特征的影响
• 2 结果分析
• 2.1 抗菌物质最小抑菌浓度的测定结果
• 2.2 抗菌物质对大肠杆菌生长曲线的影响
• 2.3 抗菌物质对大肠杆菌细胞通透性的影晌
• 2.3.1 二乙酸荧光素法测定大肠杆菌细胞通透性的变化
• 2.3.2 Fluo 3/AM荧光探针法测定细胞内钙离子浓度的变化
• 2.4 抗菌物质对大肠杆菌细胞显微特征的影响
• 3 本章小结
• 第五章 枯草芽孢杆菌WL17抗菌物质的分离纯化及结构初探
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂与材料
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 抗菌物质粗提物组成的初步分析
• 1.2.2 抗菌物质粗提物的分离纯化
• 1.2.3 高效液相制备色谱分离组分的活性研究
• 1.2.4 高效液相制备色谱分离组分的ESI/MS分析
• 2 结果分析
• 2.1 抗菌物质粗提物组成的初步研究
• 2.1.1 抗菌物质粗提物的波长扫描
• 2.1.2 抗菌物质粗提物的薄层色谱（TLC）分析
• 2.1.3 抗菌物质粗提物的HPLC分析
• 2.2 抗菌物质粗提物的分离纯化
• 2.2.1 抗菌物质粗提物的Sephadex G-75分离
• 2.2.2 抗菌物质粗提物的Sephadex LH-20分离
• 2.2.3 Sephadex LH-20分离级分的HPLC分析
• 2.2.4 级分4的HPLC分离纯化
• 2.3 高效液相制备色谱分离组分的活性研究
• 2.3.1 高效液相制备色谱分离组分的抗菌活性分析
• 2.3.2 高效液相制备色谱分离组分的抗氧化活性分析
• 2.4 高效液相制备色谱分离组分结构的初步探讨
• 2.4.1 组分Ⅰ的HPLC和ESI-MS分析
• 2.4.2 组分Ⅴ的HPLC和ESI-MS分析
• 2.4.3 组分Ⅵ的HPLC和ESI-MS分析
• 3 本章小结
• 第六章 枯草芽孢杆菌WL17抗菌物质在鱼丸保鲜中的应用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料与仪器
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 鱼丸的制作工艺
• 1.2.2 细菌总数的测定
• 1.2.3 TBA（硫代巴比妥酸）值的测定
• 1.2.4 TVB-N（挥发性盐基氮）值的测定
• 1.2.5 质构特性的测定
• 1.3 实验设计
• 1.4 数据统计分析
• 2 结果分析
• 2.1 不同添加浓度对鱼丸储藏品质的影响
• 2.1.1 抗菌物质添加浓度对细菌总数的影响
• 2.1.2 抗菌物质添加浓度对TBA值的影响
• 2.1.3 抗菌物质添加浓度对TVB-N值的影响
• 2.1.4 抗菌物质添加浓度对硬度、弹性和咀嚼性的影响
• 2.1.5 品质变化指标的相关性分析
• 2.2 抗菌物质与脉冲强光联合运用对鱼丸储藏品质的影响
• 3 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间发表的学术论文