姚虻唾液腺抗血栓物质Vsotab TY的原核表达及活性研究

论文摘要

血栓性疾病是全球总致死、致残率最高的疾病,作为临床最为常见的病症之一,血栓性疾病严重威胁着人类健康。近年来,针对血液凝固、血小板激活与聚集和血栓溶解等不同生理步骤开发出了大量的基础与临床药物,并且随着血栓性疾病发病率的不断上升,抗血栓药物市场也在迅速扩容。但是,许多抗血栓药物溶因具有出血活性、导致低血压等系统性副作用而受到限制。因此,挖掘新的特异的抗血栓药物势在必行。吸血节肢动物在长期的生存压力下,进化出一套复杂的利于其完成血餐的分子机制,这也是目前国内外研究的热点之一,通过这类研究可以挖掘出大量的具有药用前景的先导分子。本实验室通过生物化学、分子生物学以及药理学研究手段从中国特有的姚虻（Tabanus yao Macquart）唾液腺内发现抗血小板聚集物质Vasotab TY,并得到其氨基酸和核酸序列。本研究利用分子生物学等手段成功构建了Vasotab TY原核表达菌株并对其进行了原核表达,发酵后菌体通过超声破碎、Ni2+亲和柱、甲酸切割、Sephadex G-50、RP-HPLC等多种分离纯化步骤,同时利用蛋白电泳及血小板聚集抑制活性实验对目的蛋白进行跟踪,得到了具有血小板聚集抑制活性的Vasotab TY成熟肽纯品,经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）验证表达所得的Vasotab TY成熟肽纯品分子量为6224.7,与预测分子量几乎相同,同时可推断Vasotab TY氨基酸序列中的六个半胱氨酸之间形成了3对二硫键。通过小鼠尾静脉出血时间、角叉菜胶致鼠尾血栓模型、大鼠动-静脉旁路血栓模型等多种实验动物血栓模型研究了Vasotab TY的抗血栓活性,证明了Vasotab TY具有良好的抗血栓活性；并利用分子手段初步确定了Vasotab TY的活性部位为赖氨酸-甘氨酸-门冬氨酸（KGD序列）,证明了Vasotab TY是一种新的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂；另外我们通过动物出血实验断定VasotabTY在150μg/kg剂量范围内不会引起组织出血,说明Vasotab TY具有很好的安全性。本研究为Vasotab TY的产业化及临床应用提供了充分的科学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词及对照表
• 第一章 文献综述
• 1. 凝血系统与纤溶系统
• 1.1 凝血系统
• 1.2 纤溶系统
• 2. 吸血节肢动物唾液腺抗凝血活性物质研究进展
• 2.1 血小板聚集抑制因子
• 2.2 抗凝血因子
• 2.3 血管扩张因子
• 2.4 吸血节肢动物唾液腺其他活性物质
• 3. 抗血栓药物简介
• 3.1 抑制血栓形成的药物
• 3.2 溶栓药物
• 第二章 姚虻唾液腺抗血栓物质Vasotab TY的原核表达
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料、试剂与仪器设备
• 1.2 姚虻唾液腺抗血栓物质Vsatab TY表达载体的构建
• 1.3 融合表达菌株Vasotab TY+P+RT的诱导及目标蛋白的分离纯化
• 2. 结果与分析
• 2.1 Vasotab TY经过PCR加两端接头后的电泳图
• 2.2 pET-32a（+）及Vasotab TY酶切前后电泳图
• 2.3 重组质粒的鉴定及序列分析
• 2.4 IPTG诱导表达菌株
• 2.5 诱导蛋白的可溶性分析
• 2.6 融合蛋的获得与目的蛋白释放
• 2.7 甲酸切割后样品的分离纯化
• 2.8 RP-HPLC分离纯化
• 2.9 测定蛋白分子量
• 3. 小结
• 第三章 姚虻唾液腺抗血栓物质Vasotab TY的活性研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要材料与试剂
• 2.2 实验方法
• 3. 结果与讨论
• 3.1 血小板聚集抑制活性
• 3.2 角叉菜胶致小鼠尾血栓模型结果
• 3.3 大鼠动-静脉旁路血栓模型
• 3.4 血小板聚集抑制作用的机制研究
• 3.5 小鼠尾出血时间检测
• 3.6 出血毒性
• 4. 小结
• 论文总结
• 创新之处
• 攻读硕士期间获奖情况
• 参考文献
• 附录
• 致谢