论文摘要
目的:建立一种人骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）体外培养方法,探讨肝细胞生长因子（HGF）、表皮细胞生长因子（EGF）诱导MSCs 向肝细胞定向分化的可行性。方法:用Ficoll 淋巴细胞分离液分离出骨髓中的MSCs,接种于含10%胎牛血清的L-DMEM 培养液中进行原代培养,待细胞基本融合后用胰蛋白酶和EDTA 混合液消化传代。在倒置相差显微镜下观察细胞形态,台盼蓝拒染法计数细胞并绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。取第三代人MSCs 分别在含HGF、EGF、HGF+EGF 以及不含生长因子的无血清肝细胞培养基中诱导培养。在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,于诱导培养的第1、7、14、21、28 天取出细胞爬片,应用免疫细胞化学法分别检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK18）的表达,PAS 法进行糖原染色试验,并收集培养上清液用全自动生化分析仪检测ALB 和BUN的含量。结果:1、采用密度梯度离心结合贴壁培养法可成功分离出人骨髓中的MSCs。刚接种时细胞形态呈圆形、三角形或棒杆状,48h 后细胞开始贴壁,4-5d 可见有集落形成,第7d 形成多个细胞克隆,第10d 细胞呈长梭形,2w 左右可达到基本融合;传代细胞呈均匀的纺锤形,基本上无悬浮细胞。生长曲线呈现生长缓滞期、对数增殖期和生长平稳期的典型特征。流式细胞仪检测显示约有86.4%的细胞处于G0、G1 期。2、接种于含HGF、EGF 和HGF+EGF 无血清肝细胞培养基中的MSCs 于诱导第5 天均可观察到部分纺锤形细胞逐渐变圆,换液的同时诱导孔中细胞数目略有减少;第10 天左右基本
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 体外培养论文; 诱导分化论文; 肝细胞生长因子论文; 表皮细胞生长因子论文; 肝细胞论文;