论文摘要
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）,是常见的高度恶性肿瘤之一,据估计全球每年新发病例数达60万,每年因肝癌死亡的人数达到58万。中国是肝癌的高发地区之一,全球55%的肝癌病例发生在中国。而广西是我国肝癌高发区,其中扶绥县的肝癌发病占该县全部恶性肿瘤发病的61.51%,其死亡率位于肿瘤死因谱首位。肝癌恶性程度高,潜伏期长,起病隐匿,进展快,病程短,死亡率高,病死率几乎达到100%,严重威胁人们的健康与生命。在当前医疗条件下,各种治疗措施极少能改变肝癌患者最终死亡的结果。因此,对肝癌病因学以及易感性的研究具有特别重要意义。肝癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。目前已证实HBV、HCV病毒感染,吸烟,饮酒和黄曲霉毒素B1暴露等是肝癌的主要危险因素。其中慢性HBV感染是导致肝癌的重要原因,在我国90%以上肝癌患者伴有HBV感染。研究表明,机体对HBV的清除能力存在个体差异,也就是说宿主感染HBV后的病情进展及结局在很大程度上决定于其抗病毒免疫（或炎症）相关基因的多态性。随着对宿主抗HBV免疫应答及病毒致病机理了解的增加,目前人们更加关注与免疫应答有关的细胞因子基因的研究,因为它们的多态性可能对HBV感染的病程和结局产生重要影响。广西是我国原发性肝癌高发区,同时也是我国壮族人群最大的聚集地。肝癌的发病率存在种族的差异,需要从基因水平进一步地阐明。而在对一些致病基因的多态性分布进行研究时,首先了解其在正常人群中的分布特点是正确分析基因多态性与疾病之间关系的前提条件。由于研究地域、人群等的局限性,目前广西地区壮族和汉族人群的肝癌相关性细胞因子基因多态性的遗传学数据非常少。大量研究证据表明,TNF-α、白细胞介素-1B、白细胞介素-12B、转化生长因子β1等细胞因子与肝癌发生、发展密切相关。为了验证上述假设,我们开展了以医院为基础的分子流行病学研究。研究一共分为两部分。第一部分对广西200例壮族和232例汉族人群进行肝癌相关的4个细胞因子（TNF-α、白细胞介素-1B、白细胞介素-12B、转化生长因子β1）基因多态性的分析,以取得广西地区壮族和汉族人群相应的群体遗传学数据,为广西壮族和汉族肝细胞肝癌的基因遗传背景提供理论依据和分子生物学基础。第二部分研究是在广西地区开展的病例对照研究（772例原发性肝细胞肝癌患者和852例非肿瘤对照者）,重点探讨细胞因子TNF-α、白细胞介素-1B、白细胞介素-12B、转化生长因子β1基因多态性与原发性肝细胞肝癌易感性的关系。广西地区壮、汉族人群细胞因子基因多态性分析目的:对广西壮族和汉族人群进行与肝细胞肝癌相关的4个细胞因子（TNF-α、白细胞介素-1B、白细胞介素-12B、转化生长因子β1）基因多态性的分析,以取得广西地区壮族和汉族人群相应的群体遗传学数据。方法:采用以医院为基础的流行病学调查方法。全部研究对象均来自于2007年6月～2010年6月在广西医科大学第一附属医院和广西中医学院第一附属医院、广西303医院、柳州市第一人民医院就诊住院的外伤患者,且相互间无血缘关系。随机选择父母、祖父母及外祖父母均在广西地区居住的壮族人200名,汉族人232名。排除肝脏、肾脏、内分泌和心脑血管疾病,无肿瘤病史和临床特征,无遗传疾病和传染性疾病。采用统一的调查表,由经过专门培训的调查员对研究对象进行调查。调查内容包括:一般人口学资料、生活方式、既往病史、家族史等相关指标,并由受试者本人提供外周血2ml,用于基因组DNA提取。应用TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术对TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800629、TNF-αrs1800630、IL-1B rs1143623、IL-1B rs1143627、IL-1B rs16944、IL-12B rs3212227、TGFβ1 rs1800469共8个SNP位点进行基因分型。样本均数的比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验或确切概率法。所用统计软件为SPSS13.00 for windows。应用SHEsis软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验、单倍型频率计算以及连锁不平衡检验。结果:（1）研究对象人口学特征:壮族组和汉族组在性别、年龄上匹配,无统计学差异（P > 0.05）。（2）基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检测:应用SHEsis软件分别对壮族人群及汉族人群的8个功能性SNP位点基因分型结果进行了Hardy-Weinberg平衡检验。结果显示所有基因型的观察值较好地与理论值吻合（P>0.05）,表明本次实验样本具有群体代表性。（3）细胞因子各基因多态位点基因型构成和等位基因频率比较:基因分型分析结果显示: TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800629、TNF-αrs1800630、IL-1B rs1143623、IL-1B rs1143627、IL-1B rs16944、IL-12B rs3212227、TGFβ1 rs1800469位点的突变等位基因频率在壮族组中分别为20.20%、9.80%,20.50%、45.80%、49.00%、50.20%、47.20%,在汉族组中的分布分别为21.60%、9.10%、22.40%、45.90%、49.10%、48.30%、47.40%,经χ2检验,7个位点的等位基因频率在壮族组和汉族组间的分布差异均无统计学意义（P>0.05）。TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800629、TNF-αrs1800630、IL-1B rs1143623、IL-1B rs1143627、IL-1B rs16944、IL-12B rs3212227等7个位点的各基因型在壮族组和汉族组间分布差异均无统计学意义（P>0.05）。TGFβ1 rs1800469位点C和T等位基因频率在壮族组中分别为67.20%和32.80%,在汉族组中分别为59.30%和40.70%,经χ2检验,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。TGFβ1 rs1800469位点三种基因型CC、CT、TT在壮族组的分布频率分别为44.00%、46.50%、9.50%,在汉族组的分布频率分别为36.21%、46.12%、17.67%,χ2检验结果显示,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）,壮族组携带rs1800469位点野生纯合子CC基因型者较多,汉族组携带rs1800469位点突变纯合子TT基因型者较多。（4）细胞因子TNF-α及IL-1B多态位点的连锁不平衡检验:应用SHEsis软件分别对壮、汉族组的TNF-α3个SNP位点和IL-1B 3个SNP位点进行连锁不平衡检验。结果显示,壮族组和汉族组TNF-α3个SNP位点间、IL-1B 3个SNP位点间均存在强连锁不平衡。（5）细胞因子TNF-α及IL-1B的单倍型分析:用SHEsis软件分别对壮、汉族组的细胞因子TNF-α及IL-1B基因进行单倍型分析。TNF-α基因rs1799964、rs1800630、rs1800629三个位点组成的C A G、T C A和T C G单倍型是壮、汉族组中最常见单倍型;IL-1B基因rs1143623、rs16944、rs1143627三个位点组成的C C T、G C T和G T C单倍型是壮、汉族组中最常见单倍型,但所有估计的单倍型频率分布在壮族组和汉族组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）TGFβ1 rs1800469位点C和T等位基因在壮族和汉族组中的分布频率存在显著差异。TGFβ1 rs1800469位点三种基因型CC、CT、TT在壮族组和汉族的分布频率也存在显著差异（P<0.05）,壮族组携带rs1800469位点野生纯合子CC基因型者较多,汉族组携带rs1800469位点突变纯合子TT基因型者较多。（2）TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800630、TNF-αrs1800629三个多态位点之间存在连锁不平衡现象,C A G、T C A和T C G单倍型是壮、汉族组中最常见单倍型。IL-1B rs1143623、IL-1B rs16944、IL-1B rs1143627三个多态位点之间存在连锁不平衡现象,C C T、G C T和G T C单倍型是壮、汉族组中最常见单倍型,但所有估计的单倍型频率分布在壮族组和汉族组间差异无统计学意义。广西地区人群细胞因子基因多态性与肝细胞癌的关联性研究目的:探讨细胞因子TNF-α、白细胞介素-1B、白细胞介素-12B、转化生长因子β1基因多态性对广西人群原发性肝细胞肝癌易感性的影响。方法:采用以医院为基础的病例对照研究方法。所有研究对象均为从2007年6月到2010年6月,来自广西医科大学第一附属医院、附属肿瘤医院、广西中医学院第一附属医院和柳州市人民医院的并同意参与调查、经组织学病理确诊,未接受化疗和放射治疗的原发性肝细胞肝癌新发病例,共收集原发性肝细胞肝癌患者772例;对照组选自同期住院的脊柱骨科、创伤外科、美容整形外科及眼科的非肿瘤患者,按年龄、性别匹配,且与病例来自相同地区并且居住10年以上,共收集对照852例。采用调查问卷收集研究对象的基本情况、既往史、个人史、家族史、饮酒史和吸烟史等。采集研究对象外周血2 ml,采用TaqMan MGB探针等位基因分型技术对TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800629、TNF-αrs1800630、IL-1B rs1143623、IL-1B rs1143627、IL-1B rs16944、IL-12B rs3212227、TGFβ1 rs1800469等8个SNP位点进行基因分型。基因分型结果由ABI 7500 Fast System的SDS1.3.1图像分析软件进行自动分型获取。所有数据的统计分析均采用SPSS13.0统计分析软件和SHEsis软件。计数资料的比较采用χ2检验或确切概率法。并以比值比（OR）及其95%可信区间（CI）表示相对危险度。所用统计软件为SPSS13.00 for windows。Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验、单倍型频率计算以及连锁不平衡检验应用SHEsis软件。结果:（1）研究对象人口学特征:病例组与对照组在年龄、性别、民族上匹配,无统计学差异（P > 0.05）。（2）研究对象的临床资料及饮食行为习惯情况:结果显示,HCVAb分布在病例组和对照组中的差异无统计学意义（P>0.05）,乙肝病史、食鱼生、肝癌家族史、吸烟史、饮酒史、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb等的分布频率在病例组和对照组中的差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）Hardy-Weinberg平衡吻合度检验:结果表明对照组中各基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,对照组研究对象具有群体代表性。（4）细胞因子各基因多态位点基因型构成和等位基因频率比较:基因分型分析结果显示: TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800629、TNF-αrs1800630、IL-1B rs1143623、IL-1B rs1143627、IL-1B rs16944、IL-12B rs3212227、TGFβ1 rs1800469位点的突变等位基因频率在病例组中分别为21.50%、10.43%,20.60%、45.01%、49.09%、49.16%、45.79%、37.44%,在对照组中的分布分别为20.25%、10.45%、18.19%、45.83%、49.00%、49.47%、47.83%、36.38%,经χ2检验,8个位点的等位基因频率在病例组和对照组间的分布差异均无统计学意义（P>0.05）。TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800629、IL-1B rs1143623、IL-1B rs1143627、IL-1B rs16944、IL-12B rs3212227、TGFβ1 rs1800469等7个位点的各基因型在病例组和对照组间分布差异均无统计学意义（P>0.05）。TNF-αrs1800630位点三种基因型CC、CA、AA在病例组的分布频率分别为65.67%、27.46%、6.87%,在对照组的分布频率分别为67.02%、29.58%、3.40%,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）,与携带rs1800630野生纯合子CC基因型者比较,携带AA突变纯合基因型个体罹患HCC的风险是CC基因型的2.058倍（1.289～3.287）,差异有统计学意义（P<0.05）,可认为TNF-αrs1800630位点多态性与HCC的发生有统计学关联, rs1800630 AA基因型个体患HCC危险性增高, rs1800630 AA突变纯合基因型是HCC的危险基因型。（5）分层分析:按是否有乙肝病史、是否吸烟、是否有HBsAg阳性进行分层,均未能发现与HCC风险增高的基因型;按是否饮酒进行分层,结果显示:仅仅在有饮酒史者中携带TNF-αrs1800630 A等位基因者其罹患HCC的风险是携带TNF-αrs1800630 C等位基因者的1.839倍（P=0.010）。（6）细胞因子TNF-α及IL-1B多态位点的连锁不平衡检验:应用SHEsis软件分别对对照组的TNF-α3个SNP位点和IL-1B 3个SNP位点进行连锁不平衡检验。结果显示,对照组TNF-α3个SNP位点间、IL-1B 3个SNP位点间均存在强连锁不平衡。（7）细胞因子TNF-α及IL-1B的单倍型分析:用SHEsis软件分别对病例组和对照组的细胞因子TNF-α及IL-1B基因进行单倍型分析。TNF-α基因rs1799964、rs1800630、rs1800629三个位点组成的4种常见的单倍型分别为C A G、C C G、T C A和T C G,但所有估计的单倍型频率分布在病例组和对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。IL-1B基因rs1143623、rs16944、rs1143627三个位点组成的5种常见的单倍型分别C C T、C T T、G C C、G C T和G T C,其中单倍型C T T和G C C为抗风险性单倍型,其在病例组中的分布频率分别为3.00%、1.90%,在对照组中的分布频率分别为6.50%、5.50%,在病例组和对照组间的分布差异有统计学意义（P分别为3.73e-006和8.02e-008） ,携带C T T单倍型和G C C单倍型的个体罹患HCC的风险仅为携带C C T、G C T和G T C单倍型个体的0.446倍和0.332倍。而G T C为高风险性单倍型,其在病例组中的分布频率为46.70%,在对照组中的分布频率为43.10%,在病例组和对照组间的分布差异有统计学意义（P=0.034）,携带G T C单倍型的个体罹患HCC的风险为携带其余单倍型个体的1.162倍。结论:（1）TNF-αrs1800630位点AA突变纯合基因型是广西HCC发生的危险基因型,携带AA突变纯合基因型个体罹患HCC的风险是CC基因型的2.058倍（1.289～3.287）。在有饮酒史者中携带TNF-αrs1800630 A等位基因者其罹患HCC的风险是携带TNF-αrs1800630 C等位基因者的1.839倍（P=0.010）。（2）有乙肝病史、食鱼生、肝癌家族史、吸烟史、饮酒史、HBsAg阳性、携带TNF-αrs1800630位点AA基因型是广西HCC的危险因素。（3）TNF-αrs1799964、TNF-αrs1800630、TNF-αrs1800629三个多态位点之间存在连锁不平衡现象,C A G、C C G、T C A和T C G单倍型是最常见单倍型。IL-1B rs1143623、IL-1B rs16944、IL-1B rs1143627三个多态位点之间存在连锁不平衡现象,C C T、C T T、G C C、G C T和G T C单倍型是最常见单倍型,其中单倍型C T T和G C C为抗风险性单倍型,携带C T T单倍型和G C C单倍型的个体罹患HCC的风险仅为携带C C T、G C T和G T C单倍型个体的0.446倍和0.332倍。而G T C为高风险性单倍型,携带G T C单倍型的个体罹患HCC的风险为携带其余单倍型个体的1.162倍。
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