RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的体外实验研究

论文摘要

RNA干扰（RNA interfering,RNAi）是近年发展起来的一种基因沉默技术,已成为对目的基因的功能、抗病毒和抗肿瘤基因治疗方面研究的热点;与其他肿瘤基因治疗技术一样,RNAi在应用过程中同样存在靶向性的问题。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一个新成员,广泛表达于多种肿瘤组织,而在正常组织及癌旁组织中无表达或低表达。Survivin除具有抑制细胞凋亡、调节细胞有丝分裂的功能外,还参与肿瘤血管生成、引起肿瘤细胞对放疗及化疗的耐药性等。发现至今,Survivin已成为肿瘤基因治疗理想的靶点和热点。肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,发病率及恶性程度高。其早期无症状,出现症状后约30%患者已到晚期,就诊时已发生转移,手术效果差或丧失了手术机会;对放射治疗、化学治疗和激素治疗不敏感,其5年生存率不足10%,所以迫切需要寻求新的治疗手段提高疗效。近年来有研究表明Survivin在肾癌中高表达。本实验在证实人肾癌786-O高表达Survivin的基础上,利用RNAi技术,使用载体pGenesil-1构建的重组质粒shRNA-Survivin,以脂质体转染入高表达Survivin的人肾癌786-O细胞株,显著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的转录和蛋白表达,并抑制了细胞的活性,从体外细胞水平为以Survivin为靶基因的RNAi治疗肾癌提供可靠的实验室依据。目的:第一部分:检测人肾癌786-O细胞株中的Survivin基因表达水平,探讨Survivin基因在人肾癌786-O细胞株中表达的意义。第二部分:设计针对survivin基因的siRNA并与质粒载体连接,转化大肠杆菌,挑选抗性菌落扩增培养重组质粒。第三部分:根据Survivin基因高表达于肾癌以及shRNA-Survivin抑制786-O细胞内Survivin基因表达的特点,将shRNA-Survivin及对照质粒pGenesil-1转染至786-O后,了解RNA干扰Survivin基因后对786-O活性的影响,并检测转染后786-O细胞中的Survivin mRNA及蛋白表达水平。方法:第一部分:1.培养人肾癌786-O细胞株并用MTT法绘制生长曲线;2.RT-PCR检测Survivin mRNA在786-O细胞内的转录水平;3.Western-blot检测Survivin基因蛋白质的表达水平。第二部分:1.根据survivin基因在GeneBank中序列设计相应的三组阳性siRNA和一组阴性对照,其转录模板与pGenesil-1连接并转化入大肠杆菌DH5α菌株;2.挑选卡那霉素抗性菌落并扩增培养;3.提取各组卡那抗性菌落的质粒。第三部分:1.重组质粒pGenesil-1-survivin1、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、阴性对照质粒HK以脂质体转染至786-O;2.观察转染后各组细胞形态及转染率,采用MTT法绘制转染后各组及脂质体组细胞生长曲线:3.RT-PCR检测Survivin mRNA在各组的转录水平;4.Western-blot检测Survivin蛋白在各组的表达水平。结果:第一部分:1.肾癌786-O细胞株经培养其倍增时间为52.22h,与文献报道相符;2.RT-PCR显示786-O中有Survivin mRNA的表达;3.Western-blot显示786-O中有Survivin基因蛋白质的表达。第二部分:成功得到三组阳性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA 166;survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT 358;survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC 241）和一组阴性对照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三个亚型,其中除了survivin2不能与variant 2（NM001012270）匹配,只能与variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外,survivin1和survivin3均可与survivin的3个亚型匹配。第三部分:1.转染24h后,各组细胞形态相似,荧光显微镜下ABCD组可见少量绿色荧光。54h,各组部分细胞变圆,折光性降低,有较多坏死细胞,尤以A、C严重,荧光下A、B、C、D组绿色荧光较前明显增多。转染率的计算,转染各组约为35%,单纯脂质体组为0;2.RT-PCR显示S1组和S3组中Survivin mRNA的表达下调;3.Western-blot显示S1组和S3组中Survivin蛋白的表达下调。结论:第一部分:在肾癌786-O细胞中Survivin基因在mRNA和蛋白质水平均有表达,提示Survivin基因与肾癌的发生发展密切相关。为Survivin为靶点的人肾癌基因治疗奠定了理论和实验室基础。第二部分:RNA干扰主要利用双链RNA在细胞内经Dicer酶的识别、结合、酶切产生有活性的长度为21-23nt小干扰RNA,与目的基因mRNA结合并使之降解,从而抑制目的基因的表达。我们在体外合成的针对Survivin的siRNA为下一步干扰786-O细胞中Survivin的表达提供了有力的武器。第三部分:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制肾癌786-O细胞株中survivin的表达,抑制细胞的活性,为肾癌的基因治疗提供了一种新策略。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文:RNA干扰技术特异性抑制肾癌SURVIVIN表达的体外实验研究
• 前言
• 第一部分 SURVIVIN基因在肾癌786-0细胞株中的表达和意义
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 SIRNA的设计及与质粒载体的连接后转化大肠杆菌并扩增重组质粒
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 SURVIVIN基因在肾癌786-0细胞株中的表达和意义
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文结论
• 附图
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文情况