论文摘要
目的:研究integrinαV在结肠癌群集耐药中的作用及其作用机制。材料与方法:采用人结肠高分化腺癌细胞株HT29与LIM1863为研究对象,琼脂糖抑制细胞贴壁、间断水平回旋振荡方法建立HT29多细胞球模型。加入梯度浓度奥沙利铂作用2天,Cell counting kit-8检测细胞对奥沙利铂的药物敏感性。PCR扩增质粒pEGFP-N2的EGFP与CMV,并将其插入pSUPER.neo,构建pSUPER.neo.EGFP。合成分别针对integrinαV、NF kappa B、JNK1、JNK2干扰的特异性DNA,并将其插入pSUPER.neo.EGFPR的H1启动子下游HindⅢ、BglⅡ之间,而后用EcoRⅠ、XhoⅠ将H1启动子、特异性干扰片段、CMV及EGFP一并酶切下来,插入逆转录病毒pLXSN,从而构建成功可特异干扰integrinαV、NF kappa B、JNK1、JNK2表达的逆转录病毒质粒。分别将逆转录病毒质粒转染到HT29与LIM1863,G418筛选,并连续多次挑选单克隆,从而得到稳定表达逆转录病毒的,integrinαV、NF kappa B、JNK1、JNK2分别被特异性沉默的HT29细胞株（HT29/IntegrinαV-、HT29/NF kappa B-、HT29/JNK1-、HT29/JNK2-）与LIM1863细胞（LIM1863/IntegrinαV-;LIM1863/NF kappa B-、LIM1863/JNK1-、LIM1863/JNK2-）。将细胞分组,以奥沙利铂300μg/L处理1小时作为化疗组的干预因素。SDS上样缓冲液裂解细胞得到全细胞蛋白,Bio-Rad公司RC DC Protein Assay检测蛋白浓度,Western Blot检测蛋白的表达量。Pierce公司NE-PER（?）Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents提取核蛋白,Bradford比色法检测核蛋白浓度。Pierce公司LightShift Chemiluminescent EMSA Kit化学发光法EMSA检测核蛋白NF kappa B活性。为排除空载体对实验结果的干扰,相同方法检测了空载体转染细胞后的各项指标。分别取对数生长期的HT29细胞与HT29/IntegrinαV-、HT29/NF kappa B-、HT29/JNK1-、HT29/JNK2-细胞按2×107/只接种于6周龄雌性BALB/c nu/nu裸鼠前腋皮下,48小时后,按10mg/kg体重给予奥沙利铂处理。观察30天后处死,瘤体称重。单因素方差分析统计分析数据。结果:一、成功建立HT29多细胞球培养模型。1、倒置显微镜下可见细胞聚集成团;扫描电镜见多细胞球细胞黏附紧密,表面凹凸不平;HE染色显示多细胞球由多层细胞组成,随细胞球体积增大,中心出现坏死区。2、HE染色显示,随着时间的延长,多细胞球内HT29细胞出现分化。细胞排列有序,形成腺管、腺腔样结构;与LIM1863形成的腺腔、腺管相同。3、透射电镜下,HT29多细胞球及LIM1863都表现为细胞相互黏附;细胞连接常见,特别是紧密连接,而单层细胞则未见细胞连接;线粒体及内质网发达;微绒毛长而丰富。二、HT29多细胞球表现出肿瘤群集耐药性。HT29多细胞球对奥沙利铂的药物敏感性显著下降。HT29多细胞球在奥沙利铂浓度为50μg/L、500μg/L时的生存分数（（?）±s）分别为0.865±0.047、0.429±0.040;HT29单层细胞则分别为0.582±0.033、0.0930±0.020;二者有显著性差异（p＜0.05）。LIM1863在奥沙利铂浓度为50μg/L时的生存分数（（?）±s）为0.738±0.038。三、RNA干扰integrinαV,能有效、显著性地逆转HT29多细胞球与LIM1863对奥沙利铂的群集耐药性。1、利用逆转录病毒质粒介导的RNA干扰integrinαV后,WesternBlot检测示integrinαV表达明显降低。2、Western Blot检测结果示,RNA干扰integrinαV后,HT29多细胞球的磷酸化NF kappa B表达显著下降;磷酸化JNK2表达显著升高。3、NF kappa B的EMSA结果显示,沉默integrinαV后,HT29多细胞球的NF kappa B活性显著下降。4、RNA干扰integrinαV后,HT29多细胞球在奥沙利铂浓度为500μg/L时的生存分数降低为0.300±0.037（p＜0.05）;而LIM1863在奥沙利铂浓度为50μg/L时的生存分数降低为0.638±0.029（p＜0.05）。5、裸鼠皮下种植瘤结果显示,RNA干扰integrinαV的HT29对奥沙利铂的药物敏感性显著高于HT29奥沙利铂化疗组,二者的肿瘤平均重量（（?）±s）分别为（单位:g。下同。）,0.94±0.34,0.71±0.36（p＜0.05）。四、RNA干扰NF kappaB,显著性地逆转HT29多细胞球与LIM1863对奥沙利铂的群集耐药性。1、利用逆转录病毒质粒介导的RNAi沉默NF kappa B后,Western Blot检测示NF kappa B表达明显降低,EMSA显示NF kappa B活性也被抑制。2、Western Blot检测结果示,化疗后,HT29多细胞球的磷酸化NF kappa B表达显著升高;EMSA结果显示的NF kappa B活性变化趋势与Western Blot相同。3、RNA干扰NF kappa B后,HT29多细胞球的磷酸化JNK2表达显著升高。4、RNA干扰NF kappa B后,HT29多细胞球对奥沙利铂药物敏感性的变化趋势与RNA干扰integrinαV相同。在奥沙利铂浓度为500μg/L时,HT29多细胞球的生存分数降低为0.346±0.038（p＜0.05）;而LIM1863在奥沙利铂浓度为500g/mL下的生存分数降低为0.668±0.037（p＜0.05）。5、HT29/NF kappa B-种植瘤在奥沙利铂化疗后,平均瘤重下降为0.76±0.43（p＜0.05）。五、RNA干扰JNK1基因,HT29单层细胞、HT29多细胞球与LIM1863对奥沙利铂的药物敏感性无显著性改变,虽然逆转录病毒质粒介导的RNAi能有效降低其表达。六、RNA干扰JNK2基因,显著增加了HT29多细胞球与LIM1863对奥沙利铂的群集耐药性。1、利用逆转录病毒质粒介导的RNAi沉默JNK2后,Western Blot检测示,JNK2表达明显降低,磷酸化JNK2表达也被有效抑制。2、RNA干扰JNK2后,HT29多细胞球在奥沙利铂浓度为500μg/L时的生存分数升高为0.493±0.032（p＜0.05）;而LIM1863在奥沙利铂浓度为50g/mL下的生存分数升高为0.798±0.038（p＜0.05）。3、HT29/JNK2-裸鼠皮下种植瘤结果与多细胞球结果趋势一致。瘤重升高为1.10±0.46（p＜0.05）。结论:1、HT29多细胞球能较好地模拟体内尚未形成血管的微小实体瘤,为缺氧、细胞间黏附、细胞连接以及分化等研究提供了较好的细胞模型。2、建立了一套可以有效进行RNAi的普通质粒-逆转录病毒质粒系统,可稳定地、有效地、特异性沉默目的基因。3、细胞黏附分子integrinαV的激活是结肠癌群集耐药产生的重要原因之一,其机制与激活NFkappa B从而抑制JNK2信号转导通路相关。4、干扰integrinαV的表达,或阻断其激活NF kappa B、抑制JNK2的信号转导通路可以有效地逆转结肠癌群集耐药。5、沉默JNK1基因对结肠癌群集耐药性无显著改变。提示,JNK1可能在肿瘤群集耐药中不起主要作用。
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