Ghrelin在乌珠穆沁羊雌性生殖道内的表达及其真核表达载体的构建

论文摘要

Ghrelin是1999年发现的生长激素促分泌素受体（GHSR）的内源性配体,其最主要功能是通过与GHSR结合刺激生长激素的释放。最近发现生殖器官中有Ghrelin分布,提示其与生殖周期的调节和妊娠有重要关系。雌、孕激素对雌性生殖系统具有重要的调节作用,二者与Ghrelin表达之间是否有关尚无定论。目前未见有关于Ghrelin在乌珠穆沁羊生殖道内的研究报道。本文在获得乌珠穆沁羊Ghrelin （usGhl） cDNA全序列的基础上,对生殖道各组织Ghrelin mRNA进行定位;系统研究了Ghrelin基因在不同发情期和妊娠期的乌珠穆沁羊雌性生殖道各组织内的相对表达量及其与外周血中雌激素和孕酮之间的相互关系;利用体外培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞研究雌、孕激素对Ghrelin基因表达量的调节作用;建立usGhl真核表达体系,初步证实构建的重组质粒对动物生长有促进作用。本论文为反刍动物生产性能的提高奠定基础。1.根据GenBank报道的Ghrelin cDNA序列设计特异性引物,运用RT-PCR技术和RACE技术成功克隆了usGhl cDNA全序列。本研究扩增的usGhl cDNA序列全长634bp,包含由116个氨基酸编码的前原乌珠穆沁羊Ghrelin肽。使用Blast网页和DNAStar软件对得到的usGhl cDNA全序列进行分析,无论是cDNA序列还是预测的成熟肽序列都与其它哺乳动物具有较高同源性。本研究结果表明Ghrelin基因在不同动物间表现出较高保守性。2.将乌珠穆沁羊子宫体Ghrelin RT-PCR产物回收并进行地高辛探针标记,用于原位杂交技术检测Ghrelin mRNA在乌珠穆沁羊子宫体、输卵管、宫颈、阴道中的表达位置。结果为:Ghrelin mRNA在内（黏）膜层的上皮细胞和腺体中大量表达,在固有层和肌层少量表达;肌肉组织、结缔组织和外膜层不表达。说明在绵羊雌性生殖道各组织中,Ghrelin mRNA主要表达于内（黏）膜表层细胞。3.运用RT-PCR技术证实Ghrelin基因在乌珠穆沁羊子宫体、输卵管、子宫颈、阴道组织内均有表达且表达量不同:子宫体表达量最高,输卵管次之,子宫颈和阴道内的表达量最少。采用实时荧光定量PCR技术及激素电化学发光测定法研究了乌珠穆沁羊发情及妊娠期生殖道各组织Ghrelin基因表达量与体内雌、孕激素之间的关系。本研究中血清雌二醇和孕酮在发情及妊娠期的浓度变化符合家畜生理周期的一般规律。乌珠穆沁羊生殖道各组织Ghrelin基因的表达量随发情周期及是否妊娠发生规律性改变。其中子宫体、子宫颈和输卵管内Ghrelin基因的表达与雌二醇及孕酮浓度的变化基本呈正相关。阴道内Ghrelin基因的表达与雌二醇及孕酮浓度的变化没有相关性。4.将机械法、细胞沉降及密度梯度离心结合使用,成功获得了原代和传代培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞。传一代的输卵管上皮细胞分别添加不同浓度的17-β-雌二醇和孕酮,分别培养24h、48h、72h后用RQ-PCR方法检测Ghrelin基因表达情况。结果显示:17-β-雌二醇和孕酮对体外培养的绵羊输卵管上皮细胞具有促进贴壁和促生长作用;培养时间对Ghrelin基因表达无影响;一定浓度的17-β-雌二醇和孕酮对培养的输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达有促进作用。5.培养的输卵管上皮细胞添加不同浓度他莫昔芬或米非司酮后再用17-β-雌二醇或孕酮刺激输卵管上皮细胞生长24h、48h、72h。使用RQ-PCR方法检测各组细胞Ghrelin基因表达情况。结果表明:他莫昔芬和米非司酮能够抑制培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞的生长;一定浓度他莫昔芬能降低17-β-雌二醇刺激的输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达,一定浓度米非司酮能降低孕酮刺激的输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达,且二者的抑制作用均呈现剂量依赖性;培养时间对输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达量无影响。说明雌、孕激素能够促进培养的绵羊输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达,雌、孕激素是通过与其受体相结合发挥作用。6.本论文成功构建了Ghrelin真核表达质粒（pcDNA-usGhl）,该质粒能在小鼠肌肉组织中特异性表达,并能维持约20天。按1μg质粒/g体重注射pcDNA-usGhl能促进小鼠生长。注射后第10～20天内,pcDNA-usGhl组体重均显着高于空质粒组（P<0.05）,PcDNA-usGhl组小鼠的料重比与空质粒组小鼠相比有增加的趋势,但差异不显着。实验中没有发现Ghrelin重组质粒DNA整合到宿主染色体上。观察心脏、肝脏、肾脏、脑及肌肉均没有发现异常肿大及病变现象。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 Ghrelin 研究概述
• 1.2 Ghrelin 对生殖的作用
• 1.3 雌激素和孕激素及其二者拮抗剂
• 1.4 核酸疫苗
• 1.5 乌珠穆沁羊简介
• 1.6 本研究的目的及意义
• 1.7 本论文的实验路线设计
• 2 实验一 乌珠穆沁羊 Ghrelin （usGhl） cDNA 全序列的克隆及同源性分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验动物及其组织
• 2.1.2 主要仪器和试剂
• 2.1.3 引物的设计及合成
• 2.1.4 乌珠穆沁羊真胃组织总 RNA 的提取及检测
• 2.1.5 usGhl cDNA 中间序列的扩增
• 2.1.6 usGhl cDNA 中间序列的克隆及阳性质粒的筛选和鉴定
• 2.1.7 usGhl 3′末端cDNA 的克隆和序列分析
• 2.1.8 usGhl 5′末端cDNA 的克隆和序列分析
• 2.1.9 usGhl 全序列的同源性比较
• 2.2 结果
• 2.2.1 乌珠穆沁羊真胃组织总 RNA 的检测
• 2.2.2 usGhl cDNA 全序列扩增结果
• 2.2.3 usGhl cDNA 的全序列及usGhl 同源性比较
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于usGhl cDNA序列
• 2.3.2 RACE 技术
• 2.3.3 usGhl 与其它哺乳动物的同源性
• 2.4 小结
• 3 实验二 乌珠穆沁羊生殖道 Ghrelin 的 RNA 原位杂交
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验动物及其组织
• 3.1.2 主要仪器和试剂
• 3.1.3 子宫体 Ghrelin 基因 RT-PCR 产物的合成、回收
• 3.1.4 子宫体 Ghrelin 基因核酸探针的地高辛标记
• 3.1.5 原位杂交
• 3.1.6 乌珠穆沁羊生殖道各组织 HE 染色
• 3.2 结果
• 3.2.1 乌珠穆沁羊子宫体 Ghrelin RT-PCR 产物的回收
• 3.2.2 子宫体Ghrelin RT-PCR产物的地高辛标记
• 3.2.3 乌珠穆沁羊生殖道组织原位杂交检测结果
• 3.2.4 乌珠穆沁羊生殖道各组织 HE 染色结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 原位杂交技术
• 3.3.2 Ghrelin 的分布
• 3.3.3 Ghrelin 在乌珠穆沁羊雌性生殖道内的表达
• 3.4 小结
• 4 实验三 乌珠穆沁羊雌性生殖道的Ghrelin 基因与血清雌、孕激素关系的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验动物及组织
• 4.1.2 主要仪器和试剂
• 4.1.3 荧光定量 PCR 引物的设计及合成
• 4.1.4 荧光定量实验方法
• 4.1.5 发情及妊娠期乌珠穆沁羊血清中雌二醇及孕酮浓度的测定
• 4.1.6 实验数据处理
• 4.2 结果
• 4.2.1 总RNA检测
• 4.2.2 荧光定量 PCR 产物电泳检测结果及基因测序
• 4.2.3 usGhl和β-Actin荧光定量RT-PCR检测相关曲线状况
• 4.2.4 乌珠穆沁羊血清雌、孕激素浓度和生殖道usGhl 基因表达量的关系
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于实时荧光定量PCR
• 4.3.2 关于本实验结果的讨论
• 4.4 小结
• 5 实验四 雌、孕激素对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响
• 5.1 乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞的培养
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 仪器设备
• 5.1.3 实验药品
• 5.1.4 输卵管上皮细胞的培养
• 5.1.5 培养细胞的染色体核型分析
• 5.1.6 免疫组化法鉴定上皮细胞
• 5.2 雌、孕激素对培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达的影响
• 5.2.1 材料和试剂
• 5.2.2 RQ-PCR 引物的设计及合成
• 5.2.3 17-β-雌二醇对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响
• 5.2.4 孕酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响
• 5.2.5 细胞总 RNA 的提取及检测
• 5.2.6 RQ-PCR 检测培养的输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达量的方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 细胞培养结果
• 5.3.2 RQ-PCR 方法检测培养的输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达
• 5.3.3 添加17-β-雌二醇对培养的输卵管上皮细胞Ghrelin 基因表达的影响
• 5.3.4 添加孕酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 输卵管上皮细胞的培养
• 5.4.2 实验中17-β-雌二醇、孕酮浓度的确定
• 5.4.3 17-β-雌二醇和孕酮对培养的输卵管上皮细胞的影响
• 5.4.4 17-β-雌二醇和孕酮对 Ghrelin 基因表达的影响
• 5.5 小结
• 6 实验五 他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因的影响
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 试剂
• 6.1.3 RQ-PCR 引物的设计及合成
• 6.1.4 他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因的影响
• 6.1.5 细胞总 RNA 的提取及检测
• 6.1.6 添加拮抗剂后培养的输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的 RQ-PCR 检测方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞的影响
• 6.2.2 他莫昔芬浓度及培养时间对输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响
• 6.2.3 米非司酮浓度及培养时间对输卵管上皮细胞 Ghrelin 基因表达的影响
• 6.3 讨论
• 6.3.1 他莫昔芬和米非司酮对培养的输卵管上皮细胞生长的影响
• 6.3.2 关于雌、孕激素拮抗剂及其拮抗机制
• 6.3.3 添加他莫昔芬和米非司酮与 Ghrelin 基因表达的相关性
• 6.4 小结
• 7 实验六 usGhl 真核表达载体的构建及其促生长效果检测
• 7.1 实验材料及实验动物
• 7.1.1 实验动物
• 7.1.2 真核表达质粒及宿主细菌
• 7.1.3 主要试剂
• 7.1.4 主要仪器
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 pcDNA-usGhl 重组质粒的构建
• 7.2.2 动物实验
• 7.3 结果
• 7.3.1 pcDNA-usGhl 重组质粒的构建
• 7.3.2 pcDNA-usGhl 重组质粒的大量提取
• 7.3.3 pcDNA-usGhl 重组质粒对免疫小鼠体重和采食量的影响
• 7.3.4 RT-PCR 半定量检测外源 Ghrelin 基因表达情况
• 7.3.5 pcDNA-usGhl 重组质粒与小鼠基因组的整合
• 7.3.6 小鼠各主要组织的形态学观察
• 7.4 讨论
• 7.4.1 Ghrelin 核酸疫苗的构建
• 7.4.2 免疫方案及其影响因素
• 7.4.3 Ghrelin 的促生长作用
• 7.5 小结
• 8 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 作者简介