5’非编码区对猪瘟病毒C-株生物学特性的影响

论文摘要

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的猪的高度接触性、传染性疾病,给养猪业造成巨大威胁和经济损失,被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的法定传染病之一。CSF在我国时有暴发,被列为一类动物传染病,已纳入国家强制免疫计划。猪瘟兔化弱毒疫苗株（Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV）（国际上称为C株）,能引起兔体发热,细胞培养生长能力差,病毒滴度较低;猪瘟Theveral株（T株）是法国的一株低温诱变弱毒株,不引起兔体发热,细胞培养生长良好,病毒滴度较高。猪瘟病毒基因组的5′非编码区（5′-untranslated region,5′-UTR）是病毒蛋白翻译的主要调控区,没有帽子结构,具有内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Enty Site,IRES）。猪瘟病毒的翻译起始由IRES介导的不依赖帽子结构的机制完成。IRES结构和功能的改变直接影响病毒的翻译效率。我们推测CSFV 5′非编码区（5′-UTR）一级、二级结构的差异是造成CSFV C株和CSFV T株细胞适应性和病毒滴度不同的一个重要因素。本研究利用生物学软件分析比较了HCLV株、Thiverval株、石门株5′-UTR一级结构和二级结构。一级结构研究表明,CSFV C株、Thiverval株、Shimen株共有14个位点处碱基差异,其余部位完全相同,在14个位点差异中,有7个位点猪瘟Thiverval株和石门株碱基相同而与CSFV C株不同。二级结构研究表明,CSFV T株和石门株在5′-UTR结构域II和结构域III处茎环结构和数量基本无差异而与CSFV C株有明显差异,而猪瘟Thiverval株和石门株碱基相同而与CSFV C株不同的7个差异位点中,123位位于CSFV 5′-UTR结构域II上,138位和228位位于结构域III。前人研究表明在二级结构上,CSFV 5′-UTR的结构域II和结构域III对IRES功能影响较大。二级结构预测还表明CSFV C株5′-UTR自由能高于CSFV T株和石门株,自由能上升加剧其二级结构的不稳定性,可能影响病毒RNA的合成。为研究5′非编码区与CSFV C株细胞适应性和病毒滴度的关系,本研究运用反向遗传操作技术,在本实验室已构建的C株和T株感染性cDNA克隆的基础上,构建两株猪瘟嵌合病毒质粒pT5′-UTR-C和pC5′-UTR–T。通过电转染细胞成功拯救得到两株嵌合病毒vT5′-UTR-C和vC5′UTR-T,通过它们在细胞上的生长特性探讨5′-UTR与CSFV C株细胞适应性和病毒滴度之间的关系。研究表明,猪瘟嵌合病毒vT5′-UTR-C的病毒滴度比CSFV C株有所提高,即用CSFV T株5′-UTR替换C株相应片段后能改善C株在细胞上的适应性,提高其病毒滴度,证明5′-UTR影响CSFV C株的增殖效率。为研究5′-UTR与兔体反应热的关系,本研究将嵌合病毒接种兔子,观察兔子体温反应。结果显示,嵌合病毒vT5′-UTR-C可以导致兔子发热,攻毒嵌合病毒vC5′-UTR-T组兔子体温正常,说明5′-UTR与兔热反应无关。为研究猪瘟嵌合病毒对猪的影响,将嵌合病毒接种猪,猪只均没有异常表现。综合以上结果表明5′-UTR与CSFV C株在细胞上的增殖速率有关,用T株5′-UTR替换C株相应片段能改善C株细胞适应性,提高病毒滴度,同时也表明5′-UTR与兔热反应无关,但5′-UTR不是CSFV C株细胞适应性的唯一决定因素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语中英文对照表
• 第一章 文献综述
• 1.1 猪瘟概述
• 1.2 猪瘟病毒概述
• 1.2.1 猪瘟病毒基因组结构及功能
• 1.2.2 猪瘟病毒翻译起始机理
• 1.2.3 IRES研究进展
• 1.2.4 猪瘟病毒的细胞培养及增殖特性
• 1.3 反向遗传操作技术在猪瘟病毒研究中的应用
• 1.3.1 利用反向遗传操作技术研究猪瘟病毒的意义
• 1.3.2 反向遗传操作技术在猪瘟病毒中应用现状
• 第二章 本研究的目的、意义及研究内容和技术路线
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究内容和技术路线
• 2.2.1 研究内容
• 2.2.2 技术路线
• 第三章 猪瘟病毒 5′非编码区一级结构和二级结构的分析
• 3.1 实验用毒株
• 3.2 方法
• 3.2.1 CSFV RNA提取及 5′-UTR扩增
• 3.2.2 CSFV 5′-UTR一级结构的分析
• 3.2.3 CSFV 5′-UTR二级结构的分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 毒株 5′-UTR序列对比分析
• 3.3.2 毒株 5′-UTR二级结构分析结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 猪瘟嵌合病毒vT5′-UTR-C和vC5′-UTR-T的构建
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 引物设计
• 4.2 方法
• 4.2.1 猪瘟嵌合病毒质粒p T5′-UTR-C的构建
• 4.2.2 猪瘟嵌合病毒质粒p C5′-UTR -T的构建
• 4.3 结果
• 4.3.1 重叠PCR结果
• 4.3.2 p T7-t5′-UTR和pT7c5′-UTR质粒鉴定结果
• 4.3.3 嵌合病毒质粒的酶切鉴定结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 猪瘟嵌合病毒的拯救及传代病毒的鉴定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 细胞
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 猪瘟嵌合病毒质粒线性化及体外转录
• 5.2.2 猪瘟嵌合病毒的拯救
• 5.2.3 拯救病毒在SK6细胞上的传代
• 5.2.4 感染性病毒粒子的鉴定
• 5.3 结果
• 5.3.1 感染性病毒粒子的鉴定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 猪瘟嵌合病毒的拯救与传代
• 5.4.2 猪瘟嵌合病毒感染性病毒粒子的鉴定
• 5.4.3 猪瘟嵌合病毒传代病毒细胞培养特性比较
• 5.5 小结
• 第六章 动物实验
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 试验用毒株
• 6.1.2 实验用动物
• 6.2 方法
• 6.2.1 兔子实验
• 6.2.2 猪体实验
• 6.3 结果
• 6.3.1 兔热反应结果
• 6.3.2 猪体实验结果
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录 1. 主要试剂和耗材
• 附录 2. 猪临床打分表
• 致谢
• 作者简历