抗癌光敏剂诱导肿瘤细胞凋亡的线粒体信号转导通路研究

论文摘要

目的：本研究考察抗癌光敏剂酞菁锌系列化合物的抗癌活性，并以“福大赛因”PHOTOCYANINE作为研究对象，研究其对人肿瘤细胞凋亡的诱导作用，探讨其抗癌作用分子机理，可为金属酞菁类系列抗癌药物的研发提供理论依据。方法：利用MTT法考察酞菁锌系列化合物对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞BGC-823、AGS和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的体外增殖抑制情况，并以人胃上皮细胞GES-1和人胚肺成纤维细胞HELF作为对照，筛选具有高效低毒作用的光敏剂；为考察PHOTOCYANINE对HepG2细胞的作用机理，应用普通倒置显微镜和DAPI染色荧光显微镜观察药物作用前后细胞形态学变化；AO/EB、Annexin V-FLUOS/PI染色分析药物作用后细胞凋亡与坏死情况；PI单染方法研究药物对细胞周期的影响；经线粒体、溶酶体及内质网荧光染料染色后，利用激光共聚焦显微镜观察药物的亚细胞定位；利用活性氧检测试剂盒检测药物作用前后细胞内活性氧的变化情况；通过Rhodamine123染色检测药物作用前后细胞线粒体膜电位的变化；利用Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性检测试剂盒检测相关酶的表达情况。结果： MTT法证明在ZnPc、PHOTOCYANINE、ZnPcS3P1、ZnPcS4四种酞菁锌化合物中，ZnPc和PHOTOCYANINE对肿瘤细胞生长具有较强的增殖抑制作用，并对人正常细胞GES-1和HELF毒性作用较低；倒置显微镜、DAPI及AO/EB染色荧光显微镜观察验证光敏剂PHOTOCYANINE能诱导HepG2细胞出现细胞体积缩小、染色质浓缩、细胞出泡等细胞凋亡和坏死形态学改变；HepG2细胞经Annexin V-FLUOS/PI双染，利用流式细胞仪检测发现，细胞凋亡和坏死的数量随着药物浓度的升高而增加；PI染色检测药物作用后细胞周期被阻滞于G2/M期；激光共聚焦显微镜观察药物主要定位在线粒体、溶酶体及内质网中；经PHOTOCYANINE作用后的HepG2细胞，线粒体膜电位有明显降低，同时伴随着细胞内活性氧水平、Caspase-3和Caspase-9的表达均显著增加，而Caspase-8表达不明显。结论：光敏剂PHOTOCYANINE是一种高效低毒的新型抗癌药物，其对HepG2细胞作用机理推断是通过细胞膜电位降低、产生活性氧、激活Caspase-9及Caspase-3等线粒体途径诱导细胞凋亡，药物影响细胞周期阻断在G2/M期。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 引言
• 1.1 光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）简介
• 1.2 光敏剂的研究进展
• 1.2.1 第一代光敏剂
• 1.2.2 第二代光敏剂
• 1.2.3 第三代光敏剂
• 1.3 光动力疗法的作用机理
• 1.3.1 光动力疗法的化学反应机制
• 1.3.2 光动力疗法的生物反应机制
• 1.4 光动力疗法的影响因素
• 1.5 本论文的主要研究内容与创新点
• 第二章 酞菁锌系列化合物体外抗癌活性研究
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 主要药物与试剂
• 2.1.2 主要仪器与材料
• 2.1.3 常用溶剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 光敏剂时间依赖性细胞摄取研究
• 2.2.3 MTT 法检测酞菁锌系列化合物对细胞毒性作用
• 2.2.4 统计学处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 细胞对酞菁锌类光敏剂的摄取研究
• 2.3.1.1 细胞对 ZnPc 的摄取研究
• 2.3.1.2 细胞对 PHOTOCYANINE 的摄取研究
• 2.3.2 酞菁锌系列化合物对细胞的光毒性作用
• 2.3.2.1 ZnPc 对细胞的光毒性作用
• 2.3.2.2 PHOTOCYANINE 对细胞的光毒性作用
• 2.3.2.3 ZnPcS3P1对细胞的光毒性作用
• 2.3.2.4 ZnPcS4对细胞的光毒性作用
• 2.3.2.5 酞菁锌系列化合物对细胞的光毒性作用 IC50值
• 2.3.3 ZnPc 及 PHOTOCYANINE 对细胞的暗毒性作用
• 2.3.3.1 ZnPc 对细胞的暗毒性作用
• 2.3.3.2 PHOTOCYANINE 对细胞的暗毒性作用
• 2.4 讨论
• 第三章 ZnPc、PHOTOCYANINE 对人肝癌细胞 HepG2 的作用机制探讨
• 3.1 实验试剂与仪器
• 3.1.1 主要实验试剂
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 普通倒置显微镜形态学观察
• 3.2.2 DAPI 细胞形态学观察
• 3.2.3 AO/EB 法对细胞凋亡与坏死检测
• 3.2.4 Annexin V-FLUOS/PI 检测
• 3.2.5 PI 单染检测细胞周期相分布
• 3.2.6 亚细胞定位检测
• 3.2.7 活性氧检测
• 3.2.8 线粒体膜电位检测
• 3.2.9 Caspase-3 活性检测
• 3.2.10 Caspase-8 活性检测
• 3.2.11 Caspase-9 活性检测
• 3.2.12 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 普通倒置显微镜下细胞形态学观察
• 3.3.2 DAPI 染色细胞形态观察
• 3.3.3 AO/EB 染色细胞凋亡与坏死检测
• 3.3.4 Annexin V-FLUOS/PI 检测
• 3.3.5 PI 单染检测细胞周期相分布
• 3.3.5.1 ZnPc 对人肝癌细胞 HepG2 细胞周期的影响
• 3.3.5.2 PHOTOCYANINE 对人肝癌细胞 HepG2 细胞周期的影响
• 3.3.6 亚细胞定位检测
• 3.3.6.1 ZnPc 在 HepG2 细胞中的亚细胞定位
• 3.3.6.2 PHOTOCYANINE 在 HepG2 细胞中的亚细胞定位
• 3.3.7 活性氧检测
• 3.3.8 线粒体膜电位检测
• 3.3.9 Caspase-3、Caspase-8 以及 Caspase-9 酶活性检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 普通光镜及荧光显微镜观察
• 3.4.2 流式细胞术
• 3.4.3 亚细胞定位
• 3.4.4 活性氧检测
• 3.4.5 线粒体信号通路
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历