免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内分布规律研究

论文摘要

本研究通过对免疫组化方法部分条件进行优化,其中包括,3% H2O2孵育时间和浓度、抗原修复的方法、抗体稀释度及孵育时间的优化,成功建立了检测鹅细小病毒(GPV)在14日龄雏鹅体内分布的间接免疫酶组织化学染色法。经替代试验和阳性、阴性对照试验表明该法具有敏感性高和特异性好的优点。同时参照GenBank中发表的GPV基因组序列,使用引物设计软件oligo6.0设计扩增GPV NS2基因所用的一对引物,应用这对引物对感染细小病毒雏鹅组织抽提的病毒DNA进行扩增,获得了与设计大小相符合的特异性条带,成功地建立了检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内分布的PCR方法。本文结合免疫组化方法能够对病毒抗原进行定位和PCR方法敏感、特异的特点,对14日龄雏鹅感染GPV后,不同时间病毒抗原在体内的定位及分布情况进行了检测,同时应用图像分析软件对主要组织的抗原染色强度进行了定量分析。检测结果表明:感染后第1d即能在心脏、肺脏、脾脏、法氏囊、胸腺、腺胃、十二指肠、空肠、回肠和血液中检测到GPV存在;感染后第3d检测阳性组织开始增多,除上述组织外还能在肝脏和盲肠中检测到病毒抗原;感染后第4d开始能从大脑、粪便和肛门棉拭子中检测到病毒;感染后第5d可从食管中检测出GPV。此时感染组织最广泛,组织的损伤程度也最大;感染后第6d阳性组织开始减少,肝脏和肛门棉拭子中检测不出GPV存在;感染后第7d,肝脏、盲肠、粪便和血液中检测不出GPV存在;感染后第14d仅能在空肠、胸腺和食管中检测到GPV存在;感染后第21d,仅能在空肠中检测到病毒抗原。在整个检测过程中始终未能从胰腺和骨骼肌检测到GPV。免疫组化检测结果表明,病毒抗原广泛分布于肝细胞、肠道上皮细胞、腺上皮细胞,肺泡壁细胞和肾小管的上皮细胞内;可见上皮细胞为GPV的主要靶细胞并且GPV主要分布在细胞核内。通过对免疫组化阳性组织的抗原强度进行定量分析,发现感染后4~6d染色强度最为强烈。尤其肠道中的空肠抗原强度最高。对脾脏、胸腺和法氏囊的抗原强度比较分析,胸腺在免疫组织中抗原强度最高,表明雏鹅受到鹅细小病毒侵害时,机体的免疫系统发生损伤。本实验对GPV抗原在感染雏鹅主要器官组织内的分布及定位规律进行了定性和定量的研究,为兽医临床对鹅细小病毒病的防治措施的制定和进一步阐明其发病机制提供科学依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 鹅细小病毒研究进展
• 1.1.1 鹅细小病毒的特征
• 1.1.2 鹅细小病毒分子生物学研究进展
• 1.2 鹅细小病毒病研究进展
• 1.3 免疫组化技术研究进展
• 1.3.1 免疫组化技术概述
• 1.3.2 免疫组化技术在兽医学中的应用
• 1.4 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验毒株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验动物分组
• 2.2.2 鹅的饲养
• 2.2.3 样品的采集
• 2.2.4 免疫组化方法检测GPV 在雏鹅体内的分布
• 2.2.5 PCR 方法检测GPV 在雏鹅体内的分布
• 2.2.6 数据处理
• 3 实验结果
• 3.1 免疫组化方法检测GPV 在感染雏鹅体内的分布
• 3.1.1 免疫组织化学方法的优化
• 3.1.2 GPV 感染雏鹅各器官组织病毒抗原动态分布
• 3.1.3 感染雏鹅主要器官组织病毒抗原强度的动态变化
• 3.2 PCR 方法检测GPV 在感染雏鹅体内的分布
• 3.2.1 引物浓度的优化
• 3.2.2 蛋白酶K 浓度和消化时间的优化
• 3.2.3 PCR 反应条件的优化
• 3.2.4 PCR 引物特异性试验
• 3.2.5 PCR 特异性和敏感性检测
• 3.2.6 GPV 感染雏鹅各器官组织病毒的动态分布
• 4 讨论
• 4.1 检测GPV 在感染雏鹅体内分布免疫组化方法的建立和优化
• 4.2 检测GPV 在感染雏鹅体内分布PCR 方法的建立和优化
• 4.3 GPV 在感染雏鹅体内分布规律
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文