论文摘要
肝脏缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）是肝移植手术中常见的病理损害,是导致移植后移植肝功能不全的重要原因。缺血-再灌注损伤的发生机制十分复杂,其中中性粒细胞在肝窦内的扣押和活化是再灌注损伤的重要因素。肝脏缺血-再灌注过程中血小板与肝窦内皮细胞的粘附明显增多,而‘以前的研究也发现血小板活化后与白细胞的粘附也明显增多,但血小板是否直接介导白细胞和肝窦内皮细胞粘附尚不清楚,而且粘附的血小板对白细胞粘附后的跨内皮迁移的影响尚不明确。因此,研究缺血-再灌注过程中血小板对白细胞-肝窦内皮细胞间粘附和白细胞跨内皮迁移的影响及相关分子机制对于进一步明确缺血-再灌注损伤的病理生理机制具有重要意义。目的：分析在缺氧-复氧条件下,血小板对白细胞-肝窦内皮细胞间粘附和白细胞跨内皮迁移的影响及相关分子机制。方法：采用人肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell, LSEC）口健康人外周血分离提取的白细胞和血小板作为研究的细胞模型。LSEC经缺氧24小时、复氧2小时（hypoxia-reoxygenation, H-R）模拟肝脏缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）过程。将荧光染料BCECF标记的血小板分别与正常培养或缺氧-复氧处理后的LSEC共培养,用连续光谱荧光仪分析血小板与LSEC的粘附。在正常培养或缺氧-复氧处理后的LSEC的培养皿中加入荧光染料BCECF标记的白细胞和荧光染料DiI标记的血小板,在激光共聚焦显微镜下观察血小板与白细胞的粘附情况。在正常培养条件或缺氧-复氧条件下,将荧光染料BCECF标记的白细胞分别与LSEC或血小板粘附后的LSEC共培养,用连续光谱荧光仪分析白细胞与LSEC的粘附。通过抗体阻断实验以分析不同粘附分子在血小板介导白细胞-内皮细胞粘附中的作用；通过激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜技术取得血小板介导白细胞-内皮细胞粘附的直接证据。另外,我们将荧光染料标记的白细胞分别与细胞插入器（Transwell）中的LSEC和血小板粘附后的LSEC共培养,然后收集迁移后的白细胞,用连续光谱荧光仪分析白细胞的跨内皮迁移。结果：血小板与缺氧-复氧后的LSEC的粘附明显增加,与对照组相比存在显著的统计学差异。在缺氧-复氧的条件下,与对照组相比血小板与白细胞的粘附也明显增加。在存在血小板的情况下,白细胞与LSEC的粘附明显增加,而且添加血小板的数量与粘附白细胞的数量呈正相关关系。在存在血小板的情况下,白细胞与LSEC的粘附可以分别被抗粘附分子GP I b、GPⅡb、GPⅢa、ICAM-1、 VCAM-1、ELAM-1、P-selectin和CD31的单克隆抗体阻断。激光共聚焦显微镜显示,在缺氧-复氧处理的LSEC表面粘附了血小板的情况下白细胞与LSEC的粘附明显增加,且白细胞的分布和血小板的分布具有一致性。透射电子显微镜显示,在缺氧-复氧后,血小板位于白细胞和LSEC之间并伸出伪足分别与白细胞和LSEC发生粘附,从而介导了白细胞与LSEC的粘附。而白细胞的迁移实验中证实,LSEC缺氧-复氧后,在添加了血小板的情况下跨内皮细胞迁移的白细胞明显减少,与未添加血小板的缺氧-复氧组相比有统计学差异。结论：血小板表面存在与白细胞和LSEC粘附的粘附分子,在缺氧-复氧条件下,血小板粘附在肝窦内皮细胞表面,粘附的血小板介导了白细胞-LSEC的粘附,并抑制了白细胞的跨内皮迁移,从而导致白细胞在肝脏血管内的扣押,加剧缺血-再灌注损伤。