ACE-N结构域蛋白在毕赤酵母中的表达及ACE-N和C结构域的活性研究

论文摘要

血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme, ACE, EC 3.4.15.1）是一种通过肾素—血管紧张素系统（RAS）和激肽释放酶—激肽系统（KKS）,对血压调节、电解质和体液平衡、心血管系统发育和结构重塑起重要作用的锌离子蛋白水解酶,广泛存在于脊椎动物体内。研究证实,ACE参与血管紧张素（AngⅡ）的生成和缓激肽（BK）的失活,其中ACE-C结构域是使血管紧张素Ⅰ （Ang Ⅰ）分解为AngⅡ的主要活性位点,而N结构域主要参与对缓激肽的水解。目前,用于ACEI药物筛选的酶靶均属全长ACE,如Captopril、Enalapril、Benazepril、 Fosinopril等。虽然这些药物均已成为治疗高血压的一线药物应用于临床,但都同时抑制了ACE的两个结构域蛋白。这种相对非选择性的ACEI在抑制AngⅡ生成的同时也抑制了缓激肽的降解,从而产生了咳嗽、肾功能不全等副作用。在已获得高纯度,高活性ACE-C结构域蛋白的前提下,本实验室首次利用分子克隆技术在毕赤酵母中表达了ACE-N结构域蛋白,为设计特异性ACEI类药物提供基础。本文利用NCBI搜索到人源ACE基因,选择N端长为1071bp的保守序列作为目的片段。通过RT-PCR方法从TE-1细胞中反转出cDNA,用PCR扩增得到ACE-N基因片段,构建出pPIC9K-ACE-N表达载体,然后转化毕赤酵母GS115,阳性克隆再次电转后用G418筛选高拷贝的酵母菌落进行表达。经Ni2’亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11g/L,其纯度大于99%。以HHL（N-Hippuryl-His-Leu）为底物,测得ACE, ACE-N和ACE-C的酶活力分别为21.22 U/mg,1.03 U/mg,118.64 U/mg,米氏常数Km分别为1.14mM,0.92mM,1.2mM。比较其Vmax, Kcat和Kcat/Km, ACE-C远远高于ACE和ACE-N,且ACE高于ACE-N。说明ACE-C对HHL的催化效率最高,ACE次之,ACE-N最低。本研究首次在毕赤酵母中表达了人源ACE-N结构域蛋白,为ACE-N结构域蛋白的体外活性实验提供了物质基础,也为建立血管紧张素转化酶C-结构域和N-结构域的特异性抑制剂的筛选模式奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表
• 第一章 绪论
• 1 心血管疾病及相关机理
• 2 血管紧张素转化酶的研究现状
• 2.1 ACE分子结构
• 2.2 ACE基因结构
• 2.3 ACE两个活性基团的研究
• 3 ACE抑制剂
• 3.1 ACEI与ACE络合结构分析
• 4 研究目的与意义
• 第二章 ACE-N结构域的基因克隆及载体构建
• 1 前言
• 2 材料试剂、仪器和方法
• 2.1 材料试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 ACE-N基因的克隆
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 ACE-N结构域在毕赤酵母GS115中的表达与纯化
• 1 前言
• 2 材料试剂、仪器和方法
• 2.1 材料试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 ACE-N结构域的表达与纯化
• 3 结果
• 3.1 毕赤酵母重组子的鉴定和筛选
• 3.2 硫酸铵饱和度选择
• 3.3 ACE-N结构域蛋白的诱导表达纯化和鉴定
• 3.4 ACE-N结构域蛋白的浓度测定
• 4 讨论
• 第四章 ACE、ACE-N和ACE-C水解HHL酶学活性分析
• 1 前言
• 2 材料试剂、仪器和方法
• 2.1 材料试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 ACE,ACE-N,ACE-C酶学动力学分析
• 3 结果
• 3.1 蛋白浓度测定
• 3.2 马尿酸标准曲线测定
• 3.3 酶活测定结果
• 3.4 米氏常数Km测定结果
• 3.5 方法回收率与精密度试验
• 3.6 HPLC色谱图
• 4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献