S受体激酶信号传导因子SSP和MLPK编码基因的克隆与序列分析

论文摘要

杂种优势在农业生产中的广泛应用,促使在自交不亲和（SI）研究领域不断涌现出新的科研成果,对于孢子体自交不亲和反应机理的研究,芸薹属植物无疑是研究最多、机理最为清楚的一类作物。继发现并阐明了由S-locus基因编码的引发SI信号传导途径的功能因子及其功能之后,又先后发现了几类与SI信号传导途径相关疑似为该途径下游组分的蛋白质,对其功能的研究已经取得了一定的成果,但尚有很多问题亟待解决。目前普遍认为,当具有相同单倍型时,来自花粉中的半胱氨酸富含蛋白SCR/SP11与柱头上的跨膜蛋白SRK相互识别,启动SRK自磷酸化反应,从而引发SI信号传导过程,而SRK下游信号由ARC1、THL1/THL2、MOD等因子传递,最终导致花粉不能在柱头上萌发。2003年,吴能表博士从自交不亲和甘蓝中分离出一分子量为22.2KD未知蛋白,2004年Murase在芜菁中发现了MLPK蛋白,他们虽然功能还不很清楚,但无疑为自交不亲和机理的研究提供了新的内容。本研究以西南农业大学繁育的高度自交不亲和的甘蓝E1为试验材料,采用PCR、RT-PCR以及3’RACE方法克隆了SSP和MLPK基因的核DNA与cDNA序列,并利用生物学软件对其序列进行分析,利用生物信息学方法预测和探讨了蛋白质的结构和功能,以期为芸薹属植物自交不亲和性的分子机理的研究提供新的内容。主要工作与结果如下: 1.SSP基因的克降与序列分析 以甘蓝的基因组DNA和柱头总RNA为模板,采用3’RACE和PCR技术扩增SSP核DNA和cDNA。对目的片段进行回收、克隆并测序。序列分析表明,获得的SSPcDNA序列片段长度为825bp,核DNA序列片段长度为778bp,序列比对时发现SSP包含一个由654个碱基组成的外显子,没有发现内含子,编码217个氨基酸。BLAST同源性搜索显示,发现与SSP同源的核苷酸序列很少。但SSP核苷酸序列与拟南芥肽酶M28家族蛋白的核苷酸序列相似性最高达到67%,而SSP氨基酸序列同样也与拟南芥肽酶M28家族蛋白的氨酸序列相似性最高达到62%,其与水稻肽酶蛋白的序列相似性达到41.8%,与拟南芥谷氨酸羧肽酶的序列相似性达到40%。对甘蓝SSP氨基酸序列进行保守结构域搜索,结果表明SSP中含有一个TFRdimer（Transferrin receptor-like dimerisation domain）结构域,但没有发现M28家族所具有的HEXXH

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 SSI信号传导功能分子
• 1.1.1 编码基因与S-locus连锁的功能分子
• 1.1.2 编码基因与M-locus连锁的功能分子
• 1.1.3 其它SSI相关因子
• 1.2 各相关因子组成的SSI细胞信号传导途径
• 第2章 引言
• 第3章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 质粒、菌株及培养条件
• 3.1.3 工具酶和主要分子生物学试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 甘蓝基因组DNA的提取
• 3.2.2 甘蓝柱头总RNA的提取
• 3.2.3 引物设计
• 3.2.4 基因组DNA PCR扩增
• 3.2.5 总RNA的RT-PCR扩增
• 3.2.6 3'RACE操作方法
• 3.2.7 目的片段的克隆
• 3.2.8 重组体的鉴定
• 3.2.9 DNA测序
• 3.2.10 核苷酸和氨基酸序列分析
• 第4章 结果与分析
• 4.1 甘蓝核酸的提取结果与分析
• 4.1.1 基因组DNA的提取结果与分析
• 4.1.2 柱头总RNA的提取结果与分析
• 4.2 引物设计的结果与分析
• 4.2.1 SSP简并引物的设计与PCR产物特异性的关系
• 4.2.2 MLPK基因克隆的引物设计分析
• 4.3 SSP基因的克隆与序列分析
• 4.3.1 SSP基因的克隆
• 4.3.2 SSP基因的核苷酸序列分析
• 4.3.3 SSP氨基酸序列分析
• 4.3.4 SSP蛋白结构分析
• 4.4 MLPK基因的克隆与序列分析
• 4.4.1 MLPK基因的克隆
• 4.4.2 MLPK基因的核苷酸序列分析
• 4.4.3 MLPK氨基酸序列分析
• 4.4.4 MLPK蛋白结构分析
• 第5章 讨论
• 5.1 利用简并引物进行3'RACE扩增结果的讨论
• 5.2 SSP基因的核苷酸序列及氨基酸结构与功能的关系分析
• 5.3 MLPK基因的功能讨论
• 5.4 甘蓝MLPK基因内含子剪切位点与GU-AG的差异
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文及参与课题情况
• 附录