T7噬菌体展示免疫抗体库筛选阿特拉津scFv抗体的研究

论文摘要

阿特拉津,又称莠去津,是一种在全球范围内广泛使用的三嗪类除草剂。其在土壤和水体中的残留会影响人体健康并对全球生态环境造成危害。因此,对环境中阿特拉津的残留量进行实时监测和评估分析,有助于防范和应对阿特拉津所来的负面影响。目前对阿特拉津暴露风险监测和评估的方法主要是基于大型仪器,而这些方法相对耗时,且成本较高。基于免疫学抗原-抗体反应的快速检测阿特拉津残留方法则更高效、方便且经济。但免疫学方法检测的关键是要获得特异性强、亲和力高的抗体。噬菌体展示抗体库技术（Phage Display Antibody Library technology）由于能绕过杂交瘤技术或动物免疫,而成为是迄今为止发展最成熟、应用最广泛的基因工程抗体制备技术之一。免疫抗体库是指采用经过免疫后的淋巴细胞构建的抗体库。由于用于构建抗体库的淋巴细胞已经在体内经过抗原选择和亲和力成熟,因此从库容较小（105-106）的免疫库中就可以筛选到特异性强、亲和力高的抗体。本实验利用阿特拉津免疫Balb/c小鼠脾脏为抗体库基因来源构建噬菌体scFv抗体库,并用直接包被（固相）和磁珠（半固相）方法分别对scFv抗体库进行了筛选。主要研究内容和结果分述如下：1噬菌体展示免疫抗体库的构建以提取的阿特拉津免疫小鼠脾脏总RNA为模板,经M-MLV逆转录酶反转mRNA成cDNA后,PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,SOE-PCR技术连接VH、VL和GS-linker成scFv。并将scFv与T7Select（?）10-3b载体连接,经体外包装成熟后感染宿主BLT5403扩增,得到了库容量为1.0×105,滴度为2.0×1011的抗体库。2直接包被筛选阿特拉津特异抗体利用硅烷法对酶标板表面进行氨基化修饰,并利用活性酯法将羟基化的阿特拉津偶联在酶标板上。通过对抗体库进行3轮的“孵育-洗脱-扩增”直接包被固相筛选。特异性噬菌体富集了185倍。从第三轮筛选的洗脱滴度平板中随机挑取了16株噬菌体,经PCR验证共有9株噬菌体展示有scFv抗体。经测序发现有3株噬菌体所展示的scFv相同。另外随机挑取了3株噬菌体,构建pTIG-Trx-scFv表达载体。经IPTG诱导表达和纯化后,对得到的scFv抗体进行了ELISA和间接竞争ELISA测定,最终得到一株针对阿特拉津的特异性抗体。3磁珠法筛选阿特拉津特异抗体利用活性酯法将羧基化的阿特拉津与氨基化的磁珠偶联,对抗体库进行了4轮半固相筛选。特异性噬菌体富集了369倍。随机从第四轮筛选的洗脱滴度平板中挑取47株噬菌体,通过噬菌体ELISA和间接竞争ELISA对噬菌体表面展示的抗体进行了亲和力和特异性验证,得到了一株对阿特拉津有特异性的噬菌体。PCR扩增抗体基因后构建表达载体,对抗体进行了表达和纯化,并对纯化后的抗体的结合和竞争活性进行了鉴定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 噬菌体展示
• 1.1 噬菌体展示技术的基本原理
• 1.2 噬菌体展示抗体库技术
• 1.3 噬菌体展示系统分类
• 1.3.1 丝状噬菌体展示系统
• 1.3.2 λ噬菌体展示系统
• 1.3.3 T4噬菌体展示系统
• 1.3.4 T7噬菌体系统
• 1.4 其它展示系统
• 1.4.1 微生物表面展示
• 1.4.2 体外展示
• 1.5 噬菌体抗体库筛选方法
• 2 阿特拉津
• 2.1 阿特拉津的性质
• 2.2 阿特拉津的应用
• 2.3. 阿特拉津残留的影响及危害
• 2.4. 残留分析方法
• 3 研究的目的和意义
• 4. 技术路线图
• 第二章:噬菌体免疫抗体库的构建
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 质粒和菌株
• 1.2 抗体库基因的制备
• 1.2.1 提取阿特拉津免疫Balb/c小鼠脾脏总RNA
• 1.2.2 cDNA第一条链的合成
• 1.2.3 抗体基因重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的扩增
• 1.2.4 （G4S）4 linker的制备
• 1.2.5 DH5α感受态细胞的制备
• 1.2.6 GS-pMD18-T克隆载体的构建
• 1.2.7 SOE-PCR连接VH、VL、GS成scFv
• 1.3 T7噬菌体展示scFv初级库的构建
• 1.3.1 scFv片段的双酶切
• 1.3.2 scFv片段与T7噬菌体载体的连接
• 1.3.3 重组T7噬菌体载体的体外包装
• 1.3.4 重组噬菌体滴度测定
• 1.3.5 重组噬菌体的扩增
• 1.3.6 初级库的PCR及测序鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 阿特拉津免疫小鼠脾脏总RNA的提取
• 2.2 VH、VL的扩增及scFv的连接
• 2.3 初级抗体库的滴度及库容测定
• 2.3.1 初级库滴度测定
• 2.3.2 初级抗体库的PCR鉴定
• 2.4 初级抗体库的测序鉴定
• 3 讨论与结论
• 第三章:直接包被筛选阿特拉津特异性抗体
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要实验仪器
• 1.1.3 主要溶液配制
• 1.1.4 质粒与菌株
• 1.1.5 培养基
• 1.2 阿特拉津的直接包被
• 1.2.1 羧基化阿特拉津的活化
• 1.2.2 96孔酶标板的氨基化处理
• 1.2.3 ELISA测定检测阿特拉津与酶标板的偶联
• 1.3 噬菌体展示免疫抗体库的筛选
• 1.4 特异性scFv抗体的表达
• 1.4.1 pTIG-Trx-scFv表达载体的构建
• 1.4.2 scFv的诱导表达
• 1.5 特异性scFv抗体的大量表达与纯化
• 1.5.1 超声破碎细胞
• 1.5.2 HisTrap HP柱纯化scFv蛋白
• 1.6 特异scFv的性质鉴定
• 1.6.1 直接ELISA测定scFv的结合活性
• 1.6.2 间接竞争ELISA测定其特异性
• 2 结果与讨论
• 2.1 羧基化阿特拉津的活化
• 2.2 阿特拉津直接包被浓度的优化
• 2.3 抗阿特拉津噬菌体的富集
• 2.4 阳性克隆的PCR鉴定及测序
• 2.5 scFv的表达
• 2.6 Anti-Atrazine scFv的活性和特性性鉴定
• 2.6.1 直接ELISA鉴定Anti-Atrazine scFvs的结合活性
• 2.6.2 竞争ELISA鉴定Anti-Atrazine scFvs的特异性
• 3 小结
• 第四章:磁珠法筛选阿特拉津特异性抗体
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器和试剂
• 1.2 阿特拉津与磁珠的偶联
• 1.2.1 阿特拉津与磁珠偶联
• 1.2.2 偶联磁珠ELISA的鉴定
• 1.3 噬菌体展示免疫抗体库的筛选
• 1.4 特异噬菌体的挑选
• 1.4.1 噬菌体ELISA测定噬菌体的结合活性
• 1.4.2 间接竞争ELISA测定噬菌体竞争活性
• 1.5 特异性scFv抗体的表达
• 1.6 特异性scFv抗体的大量表达与纯化
• 1.7 特异scFv的性质鉴定
• 2 结果与讨论
• 2.1 阿特拉津与磁珠的偶联
• 2.2 抗阿特拉津噬菌体的富集
• 2.3 特异噬菌体的挑选
• 2.4 scFv-15的表达及纯化
• 2.6 scFv-15的性质鉴定
• 2.6.1 scFv-15的结合活性测定
• 2.6.2 scFv-15的竞争活性测定
• 小结
• 参考文献
• 致谢