水稻光敏雄性核不育基因pms3的精细定位

论文摘要

光敏感雄性核不育水稻农垦58S具有长日高温不育、短日低温可育的特点，是发展水稻“两系”法育种的重要种质资源。此前的研究发现，根据杂交组合中材料遗传背景的不同，农垦58S的不育性受到1个或2个位点的控制，位于第12染色体上的pms3位点是导致正常水稻品种农垦58突变为光敏雄性不育水稻农垦58S的根源。利用只在pms3基因位点发生育性分离的农垦58S／DH80 F2群体，pms3基因已被精细定位到两个RFLP分子标记C751和M36之间，距离分别为1.6 cM。 本研究的最终目的是遵循图位克隆法的策略，分离克隆pms3基因。我们通过对农垦58S／DH80 F2群体进行扩大，从大约7000株的F2群体中获得了892株极端雄性不育单株，利用C751和M36进行RFLP分析，分别获得了极端不育重组单株43株和17株用于对pms3基因的精细定位。根据美国Clemson大学基因组研究所释放的日本晴全基因组物理图谱信息，找到了可能覆盖pms3基因区域的日本晴BAC重叠群，结合DNA指纹技术和分子标记对60株重组单株的分析，确定了包含13个BAC克隆在内的pms3区段物理图谱。 通过利用157个BAC克隆的亚克隆作为探针对亲本农垦58S和DH80进行多态性分析，发现了4个来自不同BAC克隆的与pms3基因紧密连锁的分子标记P9、135、C11和M2，利用这4个标记对C751和M36筛选出的重组单株进行基因型分析，发现M2和P9将目标基因限定到两个相互重叠的BAC克隆73M2和71J16上。采用“鸟枪”法对可能携带pms3基因的BAC克隆73M2进行测序，获得了约160kb的基因组序列，通过搜索Monsanto公司的数据库，得到了另外108 kb的序列，将该区域的序列延伸至268 kb，同时结合对亚克隆P9和M2的序列测定，将目标基因限定到230 kb的范围内。在230 kb范围每隔5 kb左右挑选1个亚克隆作为探针，共49个探针对亲本进行分析，找到了11个在亲本间有多态性的亚克隆，利用它们作为探针继续分析该区间重组事件发生的情况，将pms3基因范围缩小至两个分子标记LJ25和LK40之间，二者相距28.4 kb，与pms3基因之间分别还有4个和2个重组单株。该28.4 kb DNA片段上包含了1在水稻花和成熟叶片中表达的基因、1个在愈伤组织和早期的幼穗中表达的基因以及5个预测的ORFs。 为了进行pms3基因的功能互补测验以及比较农垦58、DH80、农垦58S之间序列上的差异，以农垦58叶片为材料，构建了农垦58基因组BAC文库，该文库

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物基因组研究
• 1.1.1 作图群体与遗传图谱
• 1.1.2 大片段基因组文库与物理图谱
• 1.1.3 模式生物基因组测序概况
• 1.1.4 功能基因组与生物信息学
• 1.2 植物雄性不育研究
• 1.3 水稻光温敏雄性不育研究进展
• 1.3.1 代表性光、温敏雄性不育水稻材料的发现及光、温作用模式研究
• 1.3.2 光、温敏雄性不育水稻的育性转换与生理生化特性
• 1.3.3 光、温敏雄性不育基因的等位性研究与定位
• 1.4 未知产物的植物基因克隆方法
• 1.4.1 转座子与T-DNA标签法
• 1.4.2 图位克隆法
• 2 本研究的意义与目标
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 定位群体
• 3.1.2 BAC文库
• 3.1.3 遗传转化系统
• 3.2 方法
• 3.2.1 水稻总DNA的抽提
• 3.2.2 DNA浓度测定、酶切转膜、探针制备及Southern杂交
• 3.2.3 分子标记与pms3基因间距离的计算
• 3.2.4 BAC文库的构建
• 3.2.4.1 pBeloBAC11载体制备
• 3.2.4.2 水稻品种农垦58大片段基因组DNA的制备
• 3.2.4.3 载体与外源DNA最佳连接体系的摸索
• 3.2.4.4 文库质量评估
• 3.2.5 BAC克隆之间重叠关系的确定方法
• 3.2.6 BAC克隆的“鸟枪法”（shotgun）测序
• 3.2.7 携带候选基因的DNA片段生物信息学分析
• 4 结果与分析
• 4.1 极端不育重组单株的获得
• 4.2 携带pms3基因的BAC重叠群的确定
• 4.3 BAC克隆71J16的序列测定
• 4.4 目标基因区段范围的进一步缩小
• 4.5 农垦58基因组BAC文库的构建与筛选
• 4.5.1 农垦58基因组BAC文库插入片段检测
• 4.5.2 基因组覆盖率估算
• 4.5.3 农垦58基因组BAC文库的筛选
• 4.6 日本晴BAC 71J16、农垦58 BAC 10K14的shotgun随机文库构建与部分克隆的测序
• 4.7 28.4 kb DNA片段基因预测与同源性BLAST
• 4.8 28.4 kb DNA片段的比较测序及序列分析
• 4.9 基于突变位点的分子标记的发展
• 4.10 M36-C751区间重组事件频率分析
• 4.11 pms3候选基因的载体构建与遗传转化
• 4.11.1 正义转化载体构建
• 4.11.2 RNAi抑制载体构建
• 4.11.3 启动子的载体构建与表达
• 5 讨论
• 5.1 本研究结果对基因克隆及育种的贡献
• 5.2 本研究中遇到的问题与困难
• 5.3 BAC文库构建中的一些体会
• 5.3.1 联合多种酶切构建基因组文库
• 5.3.2 高质量载体的制备与保存
• 5.3.3 大片段基因组文库构建在水稻基因研究中的应用前景
• 5.4 公共数据库信息对本研究的帮助
• 5.5 关于pms3基因候选基因作用模式的一些思考
• 参考文献
• 附录Ⅰ 试剂配方与实验方法
• 附录Ⅱ 个人简历
• 致谢