嗜酸硫杆菌硫代谢在硫化矿浸出中作用及其关键酶性质研究

论文摘要

本论文比较了不同能量代谢的嗜酸硫杆菌A.ferrooxidans菌、A.thiobacillus菌对闪锌矿单独和混合浸出行为:单独的氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌浸出18天,锌浸出率分别为61%和20%,浸出速度分别为0.17g/L.day0.06g/L.day。混合浸出时,锌浸出率和浸出速度分别达到了97%和0.3g/L.day。浸出残渣分析表明:在无菌或仅有氧化亚铁硫杆菌的浸出体系的残渣表面存在着元素硫膜。然而,在氧化硫硫杆菌的浸出体系中矿物残渣表面没有硫的覆盖。结合各自的浸出率表明,这些硫膜阻碍了细菌与矿物表面的直接接触,降低了锌的浸出。氧化亚铁硫杆菌能够不断地补充浸出过程中被消耗的高价铁,使溶液保持一个高的氧化还原电位,从而使生物浸出能得以继续。氧化硫硫杆菌的角色是使元素硫膜氧化成为硫酸,消除了元素硫膜这一“钝化层”,加速酸浸效果,降低浸出体系pH,抑制铁矾的形成,有利于闪锌矿的化学性浸出。通过A.caldus在Cu2+胁迫环境下生长行为表明,Cu2+毒性能够表现在抑制细菌的呼吸作用及参与能量代谢的酶活性。在铜离子加入培养基后,对呼吸作用的抑制有约30分钟的延迟效应。当A.caldus生长在以硫单质为能源时,Cu2+影响细菌硫代谢中的亚硫酸氧化酶和APS还原酶的活性,对其他几种被调查的酶没有明显的抑制作用,进一步的试验表明Cu2+对酶的抑制作用是一种间接行为,表现为一种负相关性。分离和测定A.caldus各亚细胞结构部分的酶活及随pH的酶活性变化表明,所研究的五种硫代谢酶均位于A.caldus的细胞质或细胞内膜上。蛋白酶和缬氨霉素处理细菌表明,A.caldus能够通过膜上的跨膜转运蛋白的作用将胞内Cu2+转运出胞外,从而维持着胞内较低的Cu2+浓度,并且这种转运过程是与能量的消耗相关联。其转运蛋白类似于ATP泵的作用。从A.ferrooxidans ATCC 23270基因组中克隆并证实了一个尚未注明功能的基因,其表达产物能将硫化物中电子传递给cytochromec,因而证明该基因为硫化物脱氢酶基因。该酶在中性pH活性最高,暗示可能位于细胞质或细胞内膜。该基因在起始密码子的上游7个碱基处有典型的GGAG序列（核糖体结合位点）但无典型的-10区和-35区结构。编码的氨基酸序列与其它细菌来源的同源蛋白均含有结合FAD辅基的保守结合区和含保守的两个半胱氨酸,后者通过形成和解除二硫键,从而结合硫化氢使之成为活性位点。与SQR在氨基酸序列上有很高的同源性（39%）,在N末端包含βαβ结构域、保守的FAD结合区及与硫化物氧化有关的保守的半胱氨酸活性位点。半定量和实时定量PCR结果显示:相同能源下,FCSD的mRNA表达丰度明显高于SQR。在不同能源下,他们在亚铁培养下的mRNA表达丰度均高于单质硫和硫代硫酸钠培养下的mRNA表达丰度。然而,他们的蛋白酶的活性,以单质硫培养的酶活性最高,其次是亚铁培养的,活性最小的为硫代硫酸钠培养。这表明两个基因的表达即受到mRNA转录水平的调控,更重要的受到蛋白质翻译水平的调控。最终的蛋白酶活性测定显示FCSD和SQR在以单质硫培养的菌体内含有较其它能源培养高的酶活性,表明两者均参与了单质硫的氧化代谢。结合同工酶SQR的定位推测,两种酶在催化硫化氢的氧化时可能扮演了不同的角色,前者负责胞内硫化氢氧化,后者负责胞外硫化氢氧化。基于16s序列的系统发育分析,两个基因均出现在从古菌到真细菌的广大分布领域。他们均是一个出现较古老的参与硫代谢酶基因。FCSD的分布大于SQR的分布范围。从分布广度和mRNA表达丰度分析,FCSD在进化地位和对细菌硫代谢的贡献可能大于SQR。基于Chromatium vinosum的硫化物脱氢酶的同源模建表明,在A.ferrooxidans菌中硫化物脱氢酶中的氨基酸Cys158和Cys331参与二硫键的形成,该二硫键的成键与解键对酶与硫化物的结合与酶的催化扮演重要角色。另外,在FAD周围,推测Gly298,Ser299,Phe330,Phe332参与了蛋白质与辅基FAD之间的电子传递,Glu164与接收电子有关。对定点突变酶E164A,S299A活性测定表明:突变酶活性与非突变酶相比有很大的降低。证实上述推理的合理性,这几个氨基酸在硫化物的氧化过程中发挥了关键作用。构建了硫化物脱氢酶/纳米金/半胱氨酸/金修饰电极。该修饰电极在0.02mol/L PBS buffer（pH7.4）溶液中循环伏安扫描可见一对稳定、准可逆的氧化还原峰,其阳极峰电位（Epa）和阴极峰电位（Epc）分别为0.13V和-0.034V,式电位E0′=（Epa+Epc）/2=63mV。加入硫化钠到测试底液后,修饰电极氧化峰电流增强,还原峰电流减弱,表明固定在电极表面的硫化物脱氢酶对Na2S有电化学催化作用。对硫化钠浓度的计时响应表明,修饰电极对底物硫化物电化学响应迅速,在平均4s内达到稳态电流95%。在2×10-4-2.5×10-3mol/L范围内,响应电流与硫化钠浓度呈线性关系,其线性回归方程:ip=0.4819+2.64c,相关系数为0.992,最低检测下限1.1×10-5mol/L。固定在电极表面的酶的kmapp为4.5mmol/L。Fe3+(1.5×10-3mol/L)、K+(1.5×10-3mol/L)、NO3-(1.5×10-3mol/L)、SO42-(1.5×10-3mol/L)、柠檬酸(1.5×10-3mol/L)、葡萄糖(1.5×10-3mol/L)等六种物质对硫化钠的干扰很小,电极选择性高。考察了不同时间和批次的修饰电极对同一浓度的硫化钠(6.0×10-4mol/L)的响应,相对标准偏差RSD＜5%,表明修饰电极有良好的重现性和较好的稳定性。

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Abstract

第1章文献综述

1.1 硫杆菌概述及其研究价值

1.1.1 A.ferrooxidans菌概述

1.1.2 喜温硫杆菌概述

1.2.硫细菌的能量代谢

1.2.1 硫代谢底物多样性

1.2.2 硫杆菌的能量代谢中ATP形成过程

2的固定及生长速度的关系'>1.2.3 ATP与CO₂的固定及生长速度的关系

1.2.4 参与能量代谢的酶及代谢路径的多样性

1.2.5 几种硫杆菌硫代谢硫代谢模型

1.3 课题研究背景,目的和意义

1.4 本论文研究内容

1.5 本论文课题资助情况

第2章嗜酸硫杆菌硫代谢酶系与硫化矿微生物浸出之间的关系

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 试验菌种

2.2.2 矿样

2.2.3 浸出培养基

2.2.4 细菌培养

2.2.5 分析方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 不同组合细菌对闪锌矿的浸出

2.3.2 高价铁,亚铁对细菌浸出闪锌矿的影响

2.3.3 原始矿样及浸出残渣的分析

2.3.4 微生物硫代谢与硫化矿浸出关系

2.4 本章小结

第3章重金属胁迫下嗜酸硫杆菌硫代谢酶系的变化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验菌种

3.2.2 A.caldus细菌的培养

3.2.3 A.caldus细菌生长曲线的绘制

3.2.4 收集细菌和提取粗蛋白

3.2.5 A.caldus周质蛋白,膜蛋白,胞内蛋白分离

3.2.6 溶解氧测定

3.2.7 A.caldus细菌中硫代谢相关酶活性的测定

3.2.8 蛋白酶K和缬氨霉素对A.caldus细菌的处理

3.2.9 A.caldus亚细胞结构中铜离子浓度的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 五种硫代谢关键酶在A.caldus细菌中的亚细胞定位

2+对细菌生长影响'>3.3.2 不同浓度的Cu²⁺对细菌生长影响

2+对细菌氧代谢影响'>3.3.3 不同浓度的Cu²⁺对细菌氧代谢影响

2+对细菌裂解液中硫代谢酶活性影响'>3.3.4 在不同浓度的Cu²⁺对细菌裂解液中硫代谢酶活性影响

2+培养后细菌硫代谢酶活性变化'>3.3.5 不同浓度的Cu²⁺培养后细菌硫代谢酶活性变化

2+在细菌的亚细胞结构中的分布'>3.3.6 Cu²⁺在细菌的亚细胞结构中的分布

3.3.7 蛋白酶K作用前后细菌硫代谢酶活性变化

3.4 本章小结

第4章硫化物脱氢酶基因序列分析与克隆,原核表达及酶活性研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 A.ferrooxidans ATCC 23270基因组提取

4.2.2 目标序列的获得

4.2.2 酶切PCR产物及载体pLM1

4.2.3 载体和目的片段连接

4.2.4 克隆载体的转化

4.2.5 阳性克隆的筛选

4.2.6 蛋白质表达转化

4.2.7 蛋白质的条件表达

4.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

4.2.9 蛋白质的纯化

4.3 结果与讨论

4.3.1 硫化物脱氢酶基因的克隆策略

4.3.2 硫化物脱氢酶基因序列分析

4.3.3 硫化物氧化酶基因上下游基因序列分析

4.3.4 不同来源的硫化物脱氢酶氨基酸序列比对

4.3.5 蛋白质纯化

4.3.6 UV/Vis扫描

4.3.7 基于FCSD和SQR活性的硫化物氧化与电子传递途径

4.3.8 基于FCSD的硫化物代谢途径与细菌生理关系和地位分析

4.3.9 硫化物脱氢酶生物化学特征的研究

4.5 本章小结

第5章硫化物脱氢酶与硫醌还原酶特征比较

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 提取RNA的细菌材料准备

5.2.2 RNA的提取

5.2.3 反转录cDNA合成

5.2.4 PCR引物设计及标准曲线的制作

5.2.5 酶活性测定

5.2.6 硫化物脱氢酶及其同功酶SQR基因的进化关系分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 不同能源下,硫化物脱氢酶及其同功酶SQR基因mRNA水平表达丰度比较

5.3.2 Real time Quantitative PCR

5.3.3 不同底物下蛋白质水平的硫化物脱氢酶及其同功酶SQR活性差异

5.3.4 硫化物脱氢酶及其同功酶SQR氨基酸序列比较

5.3.5 硫化物脱氢酶及其同功酶SQR蛋白特征比较

5.3.6 硫化物脱氢酶及其同功酶SQR的进化表现

5.4 本章小结

第6章硫化物脱氢酶基因的定点突变

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 引物的设计

6.2.2 PCR扩增

6.2.3 阳性克隆的筛选

6.2.4 突变蛋白质的表达及纯化

6.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

6.2.6 紫外分光光度计（UV Scanning）

6.3 结果与讨论

6.3.1 FCSD蛋白的结构模拟与分析

6.3.2 突变序列的验证

6.3.3 硫化物脱氢酶突变体的表达纯化

6.3.4 突变型硫化物脱氢酶与其非突变型的紫外-可见光谱扫描

6.4 本章小结

第7章硫化物脱氢酶的电化学研究

7.1 引言

7.2 试验材料和研究方法

7.2.1 工作电极的修饰处理

7.2.2 电化学实验方法

7.3 结果与讨论

7.3.1 工作电极组装及电子传递机理

7.3.2 修饰电极的电化学阻抗表征

7.3.3 不同修饰电极的电化学行为

7.3.4 修饰电极对硫化物的电催化

7.3.5 硫化物脱氢酶/纳米金/半胱氨酸/金电极对硫化物的计时电流响应

7.3.6 修饰电极稳定性和抗干扰能力

7.4 本章小结

第8章结论

参考文献

致谢

附录攻读博士期间发表论文及获奖情况

一攻读博士期间发表论文

二攻读博士期间申请专利

三攻读博士期间主持或参加课题

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