MicroRNAs及其靶基因在葡萄膜黑色素瘤和胃癌发生发展中的意义

论文摘要

MicroRNAs（miRNAs）是近年来发现的一类内源性非编码小分子RNAs,通过直接降解靶基因mRNA或抑制其翻译,从而负性调控转录后基因表达。尽管其潜在的生物学功能尚未完全阐明,已发现miRNAs可参与调控一系列的细胞过程包括细胞凋亡、增殖及分化等。研究显示一些miRNA可作为一些肿瘤的诊断标志物或治疗靶点包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等。最新研究表明miRNAs的异常表达也可作为葡萄膜黑色素瘤的转移风险标志物。根据国家卫生统计部门统计,在城市癌症是首要的致死因素,而在农村则位居第三。因此,提高对癌症分子病理机制的认识和理解对促进新治疗策略的发展显得尤为重要。在本研究中,我们观察miRNAs在成人眼部发病率最高的原发性肿瘤即葡萄膜黑色素瘤和常见肿瘤胃癌的发生发展中的作用及意义。第一部分Genistein对人葡萄膜黑色素瘤细胞的作用及microRNAs机制研究Genistein作为大豆中分离出的一种异黄酮,已发现通过影响一系列的细胞过程或酶如细胞周期、凋亡、血管新生等发挥抗癌作用。然而,据我们所知,目前还没有研究关注miRNAs介导的转录调控与genistein抗癌作用之间的联系。MiR-27a作为一个原癌miRNA表达于各种癌细胞中,之前的研究显示在乳腺癌细胞中转染反义miR-27a可明显增加ZBTB10（Zinc finger and BTB domain containing 10）的表达。MiR-9被发现与肿瘤的侵袭和转移相关。因此,我们探讨genistein对葡萄膜黑色素瘤的作用并观察miR-27a及其靶基因ZBTB10的表达。同时初步分析miR-9在葡萄膜黑色素瘤侵袭性中的作用和意义。MTT结果显示genistein可浓度、时间依赖的抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的生长。治疗72小时的半数抑制率为48.23μM,且高浓度即200μM细胞存活率仅为16.7%。在体研究同时也表明genistein治疗组可明显抑制裸鼠移植瘤的生长（F = 8.849; P = 0.001）。Stem-loop实时定量PCR结果显示genistein抑制miR-27a的表达呈浓度依赖性。与对照组相比较,C918细胞经25, 50, 100, and 200μM的genistein处理后,miR-27a的表达水平分别被下降到88.9%±6.9%, 72.9%±5.4%, 51.7%±3.2%和42%±2.5%。为证实降低的miR-27a能否最终影响靶基因的转录活性,我们同时检测ZBTB10的表达,结果发现与对照组相比,ZBTB10的表达水平在genistein治疗组（200μM）明显增高（P = 0.037）。与此同时,我们观察到与高侵袭性葡萄膜黑色素瘤C918细胞比较,miR-9的表达在低侵袭性葡萄膜黑色素瘤OCM-1A细胞中是明显上调的（P < 0.001）,而且还发现genistein可诱导C918细胞株中miR-9的表达增加（P = 0.022）,暗示了miR-9的再活化可影响葡萄膜黑色素瘤的侵袭和转移。因此,在本研究中,我们首次发现了genistein的抗癌活性与miRs调控机制的相关性。第二部分Pre-miR-27a基因多态性与胃癌易感性及相关机制研究研究表明,miRNAs异常表达与人类许多癌症有关。miRNA序列的高度保守性,决定了当miRNA发生功能变异时可能会影响各种生物学过程。因此,当突变或单核苷酸多态性发生在miRNA基因时会影响pri-miRNAs的转录、miRNAs的成熟或miRNA介导的转录调控。然而,miRNA的基因多态性是否可影响胃癌易感性仍未知。本研究中,我们首先比较miR-27a及其靶基因ZBTB10在胃癌组织和癌旁组织的表达差异,并调查发生在pre-miR-27a的A/G（rs895819）多态在胃癌发生发展中的作用及意义,同时观察A/G变异对miR-27a及靶基因ZBTB10的表达影响。实时定量PCR结果显示,与癌旁正常组织比较,miR-27a过表达于胃癌组织中。相对Ct率为78.79%±5.90%和73.42±4.80%（P = 0.023）。（低的Ct率代表高的表达）相反,与癌旁正常组织比较,ZBTB10 mRNA在胃癌组织中表达降低。相对Ct率为100.30%±5.78%和110.25%±5.98%（P < 0.001）。在医院来源的包括304位胃癌患者和304位年龄、性别相匹配的对照组研究中发现,病例组中G等位基因频率为39.97%,明显高于对照组32.73%（χ2 = 6.88; P = 0.009）。SNP rs895819在病例组与对照组的基因分布明显不同（χ2 = 6.55; P = 0.038）。病例组和对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P = 0.194;P = 0.053）。与AA基因携带者相比较,变异基因（AG+GG）受试者有明显的高胃癌风险性（校正OR, 1.48; 95% CI, 1.06-2.05; P = 0.019）。分层分析显示,这种高风险在老年受试者（>58岁）,男性,非吸烟者,乡村居民患者中尤为明显,同时还发现pre-miR-27a的基因变异与淋巴结转移相关。此外,为观察突变的pre-miR-27a是否会影响miR-27a的表达,我们检测65例胃癌患者肿瘤组织的miR-27a的表达情况,结果发现与AA基因携带者相比较,AG+GG基因携带者中miR-27a的表达明显不同,相对Ct率为78.98%±7.31%和73.74%±4.34%（P < 0.001）。然而,AG+GG基因携带者中ZBTB10的表达明显低于AA基因携带者。与AA携带者相比,AG+GG受试者有较高的Ct率（107.56%±7.05%和101.68%±7.16%; P = 0.003）。我们结果指出,pre-miR-27a的一个普通多态（rs895819）通过调控miR-27a和ZBTB10表达水平,在胃癌易感性中起重要作用。

论文目录

• 中英文缩写对照表
• 中文摘要
• Abstracts
• 引言
• 第一部分 Genistein 对人葡萄膜黑色素瘤细胞的作用及microRNAs机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 Pre-miR-27a 基因多态性与胃癌易感性及相关机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 发表论文目录
• 致谢