论文摘要
背景:卡波氏肉瘤病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV）与一些获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）相关恶性肿瘤的发生密切相关,包括卡波氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma,KS）、原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma,PEL）和多中心Castleman病。人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）与KSHV之间的相互关系在AIDS-KS发生发展的过程中发挥了重要作用。本课题组先前研究发现,HIV-1反式激活蛋白（transactivative transcription protein,Tat）通过调控JAK/STAT信号通路激活体内潜伏感染的KSHV。与Tat类似,HIV-1另一种早期分泌性蛋白Nef是否能够影响KSHV的生命周期,从而参与AIDS-KS的发生?目的:研究HIV-1 Nef对KSHV潜伏感染的调节作用,并探讨其中可能涉及的包括micro RNAs（mi RNAs）和信号通路在内的分子机制。方法:运用可溶性蛋白和重组真核质粒两种系统在PEL细胞中表达HIV-1 Nef蛋白,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR）检测KSHV m RNA转录水平、免疫印迹（Western blot）和免疫荧光法（immunofluorescence assay,IFA）检测KSHV蛋白表达,以及病毒颗粒释放实验检测KSHV子代病毒颗粒的释放。为了探索其中涉及的分子机制,一方面运用micro RNA芯片检测Nef对BCBL-1细胞中mi RNAs表达水平的调节、虫荧光素酶报告实验筛选能够靶向KSHV复制和转录激活蛋白（replication and transcriptional activator,RTA）3’非翻译区（untranslated region,UTR）的mi RNAs,以及生物信息学方法和点突变实验确定候选mi RNAs在RTA 3’UTR中的结合位点;随后,分别通过功能获得性实验和功能丧失性实验鉴定Nef所调控的能够介导KSHV裂解性周期复制的mi RNAs。另一方面,通过IFA、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、虫荧光素酶报告实验和Western blot检测Nef蛋白对核因子-κB（nuclear factorκB,NF-κB）信号通路的影响;随后,运用IKK2（IκB kinase 2,IκB激酶2）过表达质粒IKK2EE以及磷酸化κB抑制因子α（inhibitor ofκBα,IκBα）抑制剂Bay11-7082来鉴定NF-κB信号通路在Nef蛋白调控KSHV潜伏感染过程中的作用。结果:KSHV阳性的PEL细胞能摄取可溶性Nef。无论是内化的可溶性Nef还是细胞内表达的Nef均能抑制KSHV裂解期的基因转录和蛋白表达,同时减少感染性子代病毒颗粒的释放。通过mi RNA芯片分析发现了一系列受Nef调节并且表达量发生差异性改变的mi RNAs;生物信息学分析和虫荧光素酶报告实验证实,宿主细胞编码的mi RNA-1258（mi R-1258）以及KSHV编码的mi RNA-K12-3*（mi R-K3*）在Nef的作用下表达上调,并且直接与KSHV裂解期开关蛋白RTA3’UTR结合。过表达这两种mi RNAs能够增强Nef对KSHV裂解性周期复制的抑制作用,而抑制这两种mi RNAs则能恢复Nef的抑制作用。另一方面,Nef蛋白可以抑制NF-κB信号;通过过表达IKK2EE提高NF-κB活性有助于Nef维持KSHV潜伏感染状态,而当用Bay11-7082降低NF-κB活性时则能恢复被Nef抑制的KSHV裂解性复制。结论:HIV-1 Nef蛋白通过调控宿主细胞编码的mi R-1258以及病毒编码的mi R-K3*维持KSHV潜伏感染状态;同时,Nef蛋白还能抑制宿主细胞NF-κB信号通路,而NF-κB信号通路在Nef蛋白抑制KSHV裂解性周期复制的过程中发挥负调控作用。
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