猪链球菌2型revS基因缺失株构建及HYL蛋白与宿主互作的研究

论文摘要

猪链球菌（Streptocuccus suis,S.suis）是当前严重危害养猪业的一种重要病原菌。根据荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）抗原成分不同,将猪链球菌分为35个血清型（1-34型和1/2型）。其中,猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）是最常见、也是毒力最强的血清型,同时也是一种重要的人兽共患病原菌。猪链球菌2型revS基因是一种反应调控因子（response regulator）,在SS2致病过程中可能起着很重要的作用。研究发现该基因能够在转录水平上对SS2多种毒力因子进行调控,缺失该基因后多种毒力因子表达减弱。鉴于此,本研究构建了猪链球菌2型revS基因缺失菌株和质粒介导的互补菌株,并对缺失菌株和互补菌株的生物学特性进行了研究,进一步研究其所调控毒力因子的表达情况,为深入研究猪链球菌2型的的分子致病机理奠定前期基础。透明质酸酶（hyaluronidase,HYL）由猪链球菌2型Hyt基因编码,该酶为粘多糖分解酶,可水解组织基质中的透明质酸,增加组织的通透性。另外也有研究报道,HYL可以作为一种调控蛋白,通过降低血中的透明质酸酶的浓来诱导血管的增生。在SS2感染过程中,细菌分泌的透明质酸酶是否可以改变宿主细胞通透性,导致链球菌及其分泌的毒力因子更容易进入宿主细胞内而发挥毒性作用有关目前还不清楚。因此,本研究利用酵母双杂交技术,以透明质酸酶作为诱饵蛋白,从小鼠的脑细胞和人的肺细胞cDNA文库中寻找HYL的互作蛋白,旨在为进一步探索HYL在SS2致病中的作用提供理论依据。鉴于以上研究背景,本研究主要开展了以下研究内容:1.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的构建与鉴定通过PCR分别扩增了revS基因上下游同源臂p1和p2基因片段、开放阅读框（ORF）和全长序列,利用温度敏感型“自杀性”质粒pSET4s构建了质粒pSET4s-p1-p2,并将该重组质粒电转化进入亲本菌SS2野生菌株SC21中,通过抗生素和温度双重标记筛选,获得revS基因缺失菌株,命名SC211。另外,将revS全长基因定向插入穿梭载体pAT18中,构建了穿梭质粒pAT18-revS,并将该质粒电转入revS基因缺失菌株SC211,通过抗生素筛选,得到质粒介导的revS基因互补菌株,命名为SC212。通过PCR、Southern blotting进一步对基因缺失突变菌株和互补菌株进行了鉴定,证实构建正确。2.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的生物学特性研究通过细菌传代培养,对缺失突变菌株SC211和互补菌株SC212的遗传稳定性进行了分析,结果显示缺失突变菌株和互补菌株能够稳定生长。比较了基因缺失突变菌株、互补菌株及野生菌株的生长特性,发现缺失菌株的生长速度明显加快,互补菌株也比野毒菌株的生长快。溶血性试验结果表明,基因缺失后SC211的溶血活性明显降低,而互补菌株SC212的溶血活性虽然有所回复,比基因缺失菌株明显提高,但是没有达到野毒菌株的水平。利用Hep2细胞为模型,研究不同菌株对细胞黏附特性,结果显示,基因缺失后链球菌对Hep2细胞的黏附能力明显下降,只有野毒菌株的29%:互补菌株虽然黏附能力比基因缺失菌株要高,但是没有达到野毒菌株的水平,只有野毒菌株的79%。以CD1小鼠为模型比较了不同菌株的毒力,结果显示基因缺失后链球菌毒力明显下降,基因缺失菌株的LD50（7.78×107）是野毒菌株LD50（7.63×106）的10倍,而互补菌株的毒力有所增高,但是没有达到野毒菌株的水平,其LD50（2.44×107）是野毒菌株的3倍。3.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的毒力相关因子的相对定量分析利用定量PCR研究了SS2毒力相关因子体内外表达情况。体外定量结果显示:除了cps和gapdh外,基因缺失菌株其他的毒力相关因子（ef,fops,hyt,sly,sod,mrp,gyrap,和rpob）的表达都要比野毒菌株低,其中ef,fbps,hyl,sly和mrp约下降了50%—80%。而互补菌株在gyrap、rpob和gapdh的表达上和野毒菌株没有明显差别,其他毒力因子（cps,ef,fbps,hyl,sod,sly和mrp）的表达都明显增高,在一定程度上上调了0.5—1.5倍。攻毒后不同时间SS2毒力相关因子的表达水平比较发现:攻毒48h后的组织中链球菌毒力相关因子的表达量要比攻毒24h和72h的高,但是差异不显著。而攻毒后不同组织中的SS2毒力相关因子的表达水平比较发现:攻毒后组织中毒力相关因子的表达量都比体外的高,差异显著（p＜0.01%）。脑组织和肺组织中链球菌毒力相关因子的表达水平比血中的高,但是差异不显著。在体内,不同菌株毒力相关因子的表达水平比较发现:在体内cps的表达野毒菌株和基因缺失菌株之间没有明显差异,但互补菌株的cps表达量是野毒菌株和基因缺失菌株的1.2倍。在基因缺失菌株中,mrp,ef,sly,fbps,sod,rpob,gyra和hyl的表达量分别比野毒菌株降低了41%,37%,29%,39%,33%,46%,36%和49%,而在互补菌株中这些毒力相关因子的表达量比基因缺失菌株增高了1.5—2.5倍,而不同组织中gapdh的表达没有差异。4.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的免疫原性的研究免疫保护性实验结果表明:106cfu的基因缺失菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供90%免疫保护,107cfu的基因缺失菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供100%免疫保护力;105cfu的互补菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供90%免疫保护力,106cfu的互补菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供100%免疫保护力。不同菌株免疫CD1小鼠后ELISA抗体水平测定结果显示:revS基因缺失后,猪链球菌2型的免疫原性并没有太大的变化,基因缺失菌株免疫后所诱导的cps抗体水平与野毒菌株差异不显著,但互补菌株的cps抗体水平明显高于野毒菌株和基因缺失菌株。5.猪链球菌2型HYL蛋白与宿主互作蛋白的筛?通过PCR方法扩增SS2 Hyl全长基因,定向克隆到pSos载体中,构建bait载体（pSos-Hyl）。将pSos-Hyl分别与鼠脑和人肺cDNA文库（pMyr-cDNA）共转化cdc25H酵母细胞,筛选与HYL相互作用的阳性克隆。经过筛选和重复验证,并对所得到的Target载体插入片段进行测序,BLAST分析,从鼠的脑组织cDNA文库中得到2个与HYL相互作用的阳性克隆,两个基因分别与锌指结构基序（widely-interspaced zinc fingermotifs gene of Mus musculus（NT-039649 REGION:18685755..18718324）,WIZF）和血管生长因子抑制因子1（ribonuclease/angiogenin inhibitor 1 gene of Mus musculus（NT-166306 REGION:2098219..2104509）,AI1）基因的同源性为99%和100%;从人的肺组织cDNA文库中得到2个与HYL相互作用的阳性克隆,两个基因分别与γ内收蛋白（Homo sapiens adducin 3（gamma）（NT030059.12）,ADD3）和装配架离子转运蛋白（Homo sapiens chromosome 6genomic contig,reference assembly,ion transporter protein（NT034880.3）,AITP）基因的同源性为99%和100%。6.猪链球菌2型HYL蛋白与宿主互作蛋白的验证与分析将Hyl克隆到pET-28c载体中,构建重组表达载体（pET28c-Hyl）进行原核表达,同时将筛选得到的WIZF、AI1、ADD3和AITP基因分别进行真核细胞表达后,用免疫共沉淀试验验证了HYL与AI1、ADD3和MTP之间的相互作用,而HYL与WIZF的证实没有发生相互作用。进一步并分析和预测了AI1、ADD3和AITP可能与SS2致病性的关系。血管上皮细胞生长抑制因子（AI1）主要是抑制血管上皮细胞的生长,从而导致血管的通透性的改变,利于细菌的扩散。而ADD3是一种内收蛋白,也是一种细胞膜骨架蛋白,内收蛋白的确切功能尚不明了,但是已知它与细胞膜表面spectrin和肌动蛋白连接部位的定向组装信号传导和跨膜离了转运有关,它的改变可以导致细胞膜的通透性的改变。AITP是一种离子转运蛋白,是细胞内外离子转运的载体,与细胞膜的离子通道和通透性有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 略语表
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪链球菌病
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 历史
• 1.1.3 病原学
• 1.1.4 流行病学
• 1.1.5 血清型
• 1.1.6 毒力（相关）因子
• 1.1.7 基因分型
• 1.1.8 致病机理
• 1.1.9 临床症状
• 1.1.10 病理变化
• 1.1.11 诊断
• 1.1.12 猪链球菌的分离与鉴定
• 1.1.13 治疗和预防
• 1.2 细菌双组分信号转导系统研究概述
• 1.2.1 双组分信号转导系统的组成及其信号转导模式
• 1.2.2 细菌双组分信号转导系统与细菌毒力的关系
• 1.2.3 细菌双组分信号转导系统的应用前景
• 1.2.4 链球菌属的双组分信号转导系统概述
• 1.3 4酵母双杂交技术
• 1.3.1 酵母双杂交技术介绍
• 1.3.2 酵母双杂交技术原理
• 1.3.3 Cyto-Trap酵母双杂交技术与传统酵母双杂交技术比较
• 1.3.4 酵母双杂交技术的应用
• 第2章 猪链球菌2型revS基因缺失株的构建及其生物学特性研究
• 2.1 研究的目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要药品及试剂
• 2.2.2 培养基与抗生素及其配制
• 2.2.3 主要缓冲液
• 2.2.4 菌株、细胞株及质粒
• 2.2.5 主要培养基和抗生素
• 2.2.6 本研究中所用的引物
• 2.2.7 实验动物
• 2.2.8 SS2基因组DNA的制备
• 2.2.9 猪链球菌2型revS基因上下游同源臂、ORF及全长序列的扩增
• 2.2.10 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 2.2.11 克隆载体的构建及测序
• 2.2.12 猪链球菌RNA的提取
• 2.2.13 RT-PCR
• 2.2.14 体外的相对定量
• 2.2.15 自杀性重组质粒和互补质粒的构建及鉴定
• 2.2.16 猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的构建及鉴定
• 2.2.17 猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的生物学特性研究
• 2.2.18 猪链球菌revS基因缺失菌株和互补菌株作为候选疫苗菌株的研究
• 2.3 结果
• 2.3.1 猪链球菌2型revS基因的克隆与序列分析
• 2.3.2 自杀质粒pSET4s-P1-P2和互补质粒pAT18-revS的构建及鉴定
• 2.3.3 猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的筛选与鉴定
• 2.3.4 猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的生物学特性研究
• 2.3.5 猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株作为候选疫苗菌株的研究
• 2.4 讨论
• 2.4.1 猪链球菌2型revS与链球菌致病性的关系
• 2.4.2 pSET4s自杀性穿梭质粒在缺失菌株构建中的问题
• 2.4.3 pAT18质粒介导互补菌株构建中的问题
• 2.4.4 猪链球菌的电转化与突变菌株的构建
• 2.5 小结
• 第3章 HYL与宿主细胞蛋白相互作用研究
• 3.1 研究目的与意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要药品与试剂
• 3.2.2 主要缓冲液
• 3.2.3 菌株、细胞株及质粒
• 3.2.4 引物
• 3.2.5 培养基
• 3.2.6 cDNA文库
• 3.2.7 试剂盒
• 3.2.8 SS2基因组DNA的制备
• 3.2.9 PCR扩增Hyl基因
• 3.2.10 pMD-18T-Hyl克隆载体的构建及测序
• 3.2.11 pSos-Hyl及pET-28c-Hyl重组载体的构建
• 3.2.12 cDNA文库扩增
• 3.2.13 cdc25H酵母细胞表型的鉴定
• 3.2.14 pSos-Hyl自激活活性的验证
• 3.2.15 共转化cdc25H酵母细胞及培养
• 3.2.16 菌落的复制培养及候选阳性克隆的选择
• 3.2.17 转化效率的计算
• 3.2.18 候选阳性克隆Target质粒的提取
• 3.2.19 候选阳性克隆质粒的扩增及酶切鉴定
• 3.2.20 Target质粒自激活活性的验证
• 3.2.21 阳性质粒DNA测序及分析
• 3.2.22 HYL原核表达
• 3.2.23 WIZF,AI1,ADD3和AITP的克隆
• 3.2.24 真核表达载体的构建
• 3.2.25 WIZF、AI1、ADD3和AITP的真核表达
• 3.2.26 Western-blotting检测WIZF、AI1、ADD3和AITP表达产物
• 3.2.27 免疫共沉淀试验
• 3.3 结果
• 3.3.1 猪链球菌2型Hly基因的PCR扩增
• 3.3.2 重组载体的构建与鉴定
• 3.3.3 cdc25H酵母细胞表型的鉴定
• 3.3.4 pSos-Hyl自激活活性的验证
• 3.3.5 共转化cdc25H酵母细胞及阳性克隆的筛选
• 3.3.6 转化效率的计算
• 3.3.7 Target质粒自激活活性的验证
• 3.3.8 Target质粒的酶切鉴定
• 3.3.9 测序及BLAST分析
• 3.3.10 SDS-PAGE和Western-blotting检测HYL原核表达
• 3.3.11 WIZF、AI1、ADD3和AITP基因的PCR扩增
• 3.3.12 真核表达载体的酶切鉴定
• 3.3.13 WIZF、AI1、ADD3和AITP的真核表达
• 3.3.14 免疫共沉淀试验
• 3.4 讨论
• 3.4.1 猪链球菌与宿主相互作用研究
• 3.4.2 酵母双杂交技术的应用
• 3.4.3 CytoTrap酵母双杂交系统
• 3.4.4 HYL与SS2致病性的关系
• 3.4.5 AI1的功能及其与致病的关系
• 3.4.6 ADD3的功能及其与致病的关系
• 3.4.7 AITP的功能及其与致病的关系
• 3.4.8 cDNA文库与互做蛋白的筛选
• 3.4.9 Bait蛋白自激活作用
• 3.4.10 Target蛋白的自激活作用
• 3.4.11 酵母细胞互补突变
• 3.4.12 酵母双杂交系统的假阳性
• 3.4.13 感受态细胞的制备及转化效率
• 3.4.14 未调到透明质酸或其亚基的原因
• 3.4.15 免疫共沉淀试验
• 3.5 小结
• 第4章 全文总结
• 参考文献
• Curriculum Vitae
• 博士期间发表的主要论文
• 致谢