水稻花期突变体的筛选与分析

论文摘要

生育期是决定水稻品种地区及季节适应性的重要性状，生育期的遗传研究与指导育种实践、品种改良及品种推广密切相关。缩短水稻生育期，对提高水稻产量和改良水稻品质具有十分重要的意义。突变体是进行基因功能研究的良好材料，近年来大规模T-DNA标签库的创建产生了大量的突变体，包括早熟和迟熟突变体，利用突变体克隆控制水稻花期的基因是可行的。同时，水稻作为短日照模式植物，将与长日照模式植物拟南芥一起，在最终揭开植物成花机理的研究中发挥不可替代的作用。本研究从独立的T-DNA插入标签系群体中（包括激活标签系和增强子捕获标签系）筛选出花期突变体，并对突变体插入位点侧翼序列进行扩增与分析，完善了一套利用标签突变体克隆基因的方法。获得主要结果如下：1．对近5万份T-DNA插入标签系进行了田间调查和筛选，结果获得有明显表型的花期突变体约350份。其中筛选到早熟突变体237份，晚熟突变体126份。增强子捕获系突变频率比激活标签系高0.1％。大多数早熟突变体与对照日本晴相比至少提早抽穗一个月，少数突变体花期提早近2个月。有4株抽穗期延迟一个月仍不能抽穗。2．采用PCR-Walking方法分离扩增插入位点的侧翼序列，并对它进行了一些改进。实验证明，DraI酶切扩增效率要高于SspI，用两种酶DraI和SspI酶切可以获得更多侧翼序列；第二轮PCR反应体系体积由20μL变成40μL，药品用量相应加倍，扩增效率不会下降。从350个样品中扩增出278条T-DNA侧翼序列和289条Tos17插入侧翼序列，T-DNA和Tos17侧翼序列扩增效率约80％；测序总共得499条成功序列，其中T-DNA有244条，Tos17有255条，T-DNA和Tos17侧翼序列成功测序效率达88％。3．对T-DNA和Tos17插入的位置进行了初步分析，表明Tos17倾向插入基因内，而T-DNA插入基因内与基因间没有偏好性。T-DNA标签系两个载体比较分析表明：增强子捕获系扩增条带效率大于激活标签系，但是扩增得到有效水稻序列的效率小于激活标签系。4．阐明了T-DNA插入不同位置产生的效应。T-DNA插入引起基因功能失活或基因表达量上升或下降。激活标签插入基因内导致基因功能失活，35S在基因上游和下游对基因起激活作用；列举了多点插入同一基因和同一突变体多点突变等情况。5．对插入位置的基因或基因编码蛋白的功能进行了研究，主要以Hd1、蛋白激酶为主。对基因功能进行预测，得到了约60个候选基因，其中2个侯选基因已经通过共分离得以确认。探讨了标签法克隆水稻花期基因与预期设想还有很大差距的几方面原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 高等植物开花时程研究
• 1.2 标签突变体的研究
• 1.3 本研究主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 载体
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.3 药品和试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 田间种植规划与数据统计方法
• 2.2.2 DNA提取
• 2.2.3 PCR-Walking方法进行侧翼序列扩增
• 2.2.4 PCR产物的回收
• 2.2.5 侧翼序列的测定
• 2.2.6 侧翼序列的同源性比对
• 2.2.7 突变表型与T-DNA插入共分离
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻花期突变体的筛选
• 3.1.1 水稻花期突变体统计结果
• 1代不同载体分类'>3.1.2 花期突变体T₁代不同载体分类
• 3.1.3 花期突变体的表现
• 1代的遗传规律'>3.1.4 两种T-DNA突变标签系T₁代的遗传规律
• 3.2 PCR-Walking方法扩增侧翼序列
• 3.2.1 不同酶酶切的DNA扩增效率比较
• 3.2.2 不同第二轮PCR反应体系的扩增效率比较
• 3.2.3 侧翼序列的统计
• 3.2.4 增强子捕获与激活标签扩增效率比较
• 3.3 T-DNA与Tos17在水稻基因组上的插入位点分析
• 3.3.1 插入位点在不同染色体上的分布
• 3.3.2 插入位点在基因组中的分布
• 3.3.3 不同插入位点产生的效应
• 3.3.4 T-DNA和Tos17多点插入基因组
• 3.4 突变体与T-DNA的共分离分析
• 4 讨论
• 4.1 水稻花期突变体筛选
• 4.2 分离扩增插入位点侧翼序列
• 4.3 标签突变体的研究
• 4.4 水稻花期相关基因或基因编码蛋白功能研究
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢