论文摘要
柚皮苷在柚苷酶的催化下能够发生水解反应:它首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下分解成鼠李糖和苦味只有柚皮苷三分之一的普鲁宁;同时,普鲁宁又在β-D-葡萄糖苷酶的作用下分解成葡萄糖和无苦味的柚皮素。它具有抗溃疡、抗氧化、消炎等多种生物活性,然而由于溶解性差,致使其在食品、药品及化妆品工业上的应用受到了限制。为了提高柚皮苷的生物利用价值,本文采用柚苷酶分别对游离态和固定化的柚皮苷进行了酶法转化研究,并对柚皮苷及其转化产物柚皮素的体外抑菌和清除自由基活性进行了初步评价。主要结果如下:（1）采用DNS法和HPLC法对柚皮苷的转化过程进行动态分析的结果基本一致。因此,可以依据柚皮苷转化过程中还原糖的变化来分析柚皮苷的动态转化过程。柚苷酶催化柚皮苷水解为柚皮素的最适酶反应温度为50oC,pH值为5.0,酶用量为8 U/mL,底物浓度为0.2 g/100 mL。在此条件下,柚皮苷酶解150 min后,转化率达85.1%,其后随着酶解时间的延长,柚皮苷的转化率基本不再增加。连续分批投料方式下,各批次投料的反应中还原糖生成量的变化趋势相似,但随着投料次数的增加,反应到达平衡所需的时间会有所延长,但每次投料反应150 min后,柚皮苷的转化率基本相同。Lineweaver-Burk双倒数拟合曲线为:y=0.0094x+22.736,测得Km为413.44μg/mL,Vmax为0.022 mg/（min·mL）。通过紫外光谱、红外光谱和高效液相色谱法分析发现,分离纯化所得的物质为柚皮素,其纯度达92.1%。（2）固定化柚皮苷的最适载体树脂为XAD-7HP型弱极性聚烷酯大孔吸附树脂。柚苷酶催化固定化柚皮苷水解的最适酶用量为8 U/mL,底物浓度为0.2 g/100 mL,pH值为5.0,温度为50oC,振荡速率为80次/min。在此条件下,酶解6 h后,反应基本达到平衡,此时柚皮苷的转化率达93.5%。Lineweaver-Burk双倒数拟合曲线为:y=0.0008x+0.8627,同时测得柚苷酶催化固定化柚皮苷生成柚皮素反应的米氏常数Km为927.32μg/mL,最大反应速率Vmax为0.023 mg/（min·mL）。最适反应条件下,试验放大前后柚苷酶催化固定化柚皮苷酶解反应的变化基本一致,放大试验中,当反应进行6 h时,柚皮苷的转化率可达到89.8%;相比于分批投料方式而言,一次性投入5倍底物量的放大试验中柚皮苷的水解速率较快,反应10 h后柚皮苷的转化率达90.2%,适于工业化生产。利用紫外光谱、红外光谱和高效液相色谱法对产物进行分析发现,分离纯化后得到的物质为柚皮素,柚皮素纯度约达95.8%。（3）以柚皮苷及其酶解产物柚皮素为考察目标,采用抑菌圈法测定其抑菌活性,通过测定它们对Fe3+的还原能力、对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）的清除能力,来评价它们的体外抗氧化性能。抑菌实验结果表明,在相同的实验条件下,柚皮素的抑菌能力要明显强于柚皮苷,且柚皮素对革兰氏阳性菌的抑制作用要强于革兰氏阴性菌,但两者对黑曲霉菌未表现出抑制效果。而体外抗氧化试验结果表明,在相同的浓度下,柚皮苷、柚皮素及对照物BHT对DPPH自由基的IC50分别为7.044 mg/mL,1.277mg/mL和0.035 mg/mL,对羟自由基的IC50分别为1.499 mg/mL,1.288 mg/mL和1.081mg/mL,总还原能力为BHT>柚皮素>柚皮苷。本研究通过对游离态和固定化柚皮苷的酶解转化反应进行考察,阐明了柚苷酶催化柚皮苷水解的动态变化过程;比较了柚苷酶催化不同状态的柚皮苷水解转化的差异;其次通过对柚皮苷及其酶解产物柚皮素的体外抑菌和抗氧化活性的评价,得出柚皮苷的酶解产物柚皮素的生物活性要强于柚皮苷,从而为柚皮苷及柚皮素作为天然防腐剂和抗氧化剂的开发利用提供了理论基础。