辣根过氧化物酶的新型包埋及其性能研究

论文摘要

本文阐述了一种酶蛋白质分子的新型包埋方法：在酶的包埋过程中,首先,采用了化学修饰的方法,在酶表面引入不饱和键；其次,修饰酶与含双键单体进行自由基聚合,对酶实施共价包埋,使得酶与载体形成了多点连接。文中重点讨论了包埋酶的制备过程、包埋酶在水溶液中的催化性能以及化学因素对其催化活性的影响。包埋酶制备过程：本文以N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）为修饰剂,通过其与酶上的氨基反应,对辣根过氧化物酶（HRP）进行化学修饰；然后在修饰酶中加入聚乙二醇400（200）二（甲基）丙烯酸酯和丙烯酰胺作为聚合原料,通过加入自由基引发剂引发聚合反应,获得了4种新型包埋的辣根过氧化物酶。实验结果表明,当HRP与NAS摩尔比约为1：20000,修饰时间为1h时,辣根过氧化物酶分子侧链修饰结果最佳；自由基聚合采用最佳原料配比为：辣根过氧化物酶液10ml,丙烯酰胺50mg,单体5g,其中单体分别为聚乙二醇400二丙烯酸酯（单体A）、聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯（单体B）、聚乙二醇200二丙烯酸酯（单体C）、聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯（单体D）。本文对包埋酶在水溶液中的催化性能进行了研究,实验结果表明：四种包埋辣根过氧化物酶A-HRP、B-HRP、C-HRP和D-HRP的相对活性分别为107.8%、47.1%、104.3%和23.3%；在高温80℃时,四种包埋酶活性都有所保留,其中A-HRP保留的活性最高为42.1%,而此温度下游离酶几乎完全失活；当包埋酶C-HRP重复使用5次后,仍保留62.1%的初始活性；在4℃下储存30天后,包埋酶A-HRP活性几乎没有下降,而游离酶液活性下降了62%,储存75天后,A-HRP活性仍为原来的55.7%,而游离酶液在储存50天后出现菌落,蛋白质变质。实验中还考察了化学因素对辣根过氧化物酶催化性能的影响。在强酸（pH=3.0）条件下,游离HRP相对活性低于8%,而包埋酶C-HRP相对活性为47.9%；在强碱（pH=11.0）条件下,游离HRP相对活性为13.8%,而C-HRP相对活性为39.7%；游离酶液最适pH范围在5.0～7.0,当pH>7时,其活性急剧下降,而当pH>7时,包埋酶C.HRP仍然保留较高的活性。在金属离子溶液中随着金属离子价态升高,HRP活性呈下降趋势。室温25℃下,用0.5%SDS浸泡30d后,四种包埋酶催化活性仍然有36%以上；用6mol/L脲浸泡30d后,A-HRP催化活性仍有62.7%。在有机溶剂体系的酶催化反应中,随着有机溶剂疏水参数logP的增加,HRP的催化活性增大,当采用异辛烷（logP=4.5）时,酶的催化活性达到最大。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目次
• 1 绪论
• 2 文献综述
• 2.1 辣根过氧化物酶
• 2.1.1 辣根过氧化物酶简介
• 2.1.2 辣根过氧化物酶的催化性能
• 2.1.3 辣根过氧化物酶的研究现状
• 2.2 酶蛋白分子侧链的化学修饰
• 2.2.1 蛋白质分子的功能基团
• 2.2.2 功能基团的化学修饰
• 2.3 蛋白质的单分子包埋
• 2.3.1 蛋白质的单分子包埋
• 2.3.2 单分子包埋蛋白质的性能
• 2.3.3 蛋白质单分子包埋的优缺点
• 2.4 酶催化性能的影响因素
• 2.4.1 化学因素对酶催化性能的影响
• 2.4.2 物理因素对酶催化性能的影响
• 2.5 本文研究
• 3 N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的合成
• 3.1 实验材料与设备
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要实验设备
• 3.2 实验内容
• 3.2.1 N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的合成
• 3.2.2 反应溶剂的选择
• 3.2.3 丙烯酰氯滴加时间的影响
• 3.2.4 反应时间的选定
• 3.2.5 精制过程
• 3.2.6 辣根过氧化物酶的荧光检测
• 3.2.7 合成的NAS修饰辣根过氧化物酶的荧光检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 反应条件对N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺合成的影响
• 3.3.2 精制过程对N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺合成的影响
• 3.3.3 N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的红外光谱检测
• 3.3.4 经NAS修饰的酶液的荧光光谱检测
• 3.4 小结
• 4 包埋辣根过氧化物酶的制备及其表征
• 4.1 实验材料与设备
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验设备
• 4.2 实验内容
• 4.2.1 辣根过氧化物酶液的配置
• 4.2.2 过氧化氢含量测定——高锰酸钾法
• 4.2.3 蛋白质含量的测定——考马斯亮蓝染色法
• 4.2.4 游离辣根过氧化物酶的活性测定
• 4.2.5 辣根过氧化物酶活性测定条件的选择
• 4.2.6 辣根过氧化物酶的侧链修饰
• 4.2.7 辣根过氧化物酶的包埋
• 4.2.8 包埋辣根过氧化物酶活性测定
• 4.2.9 包埋辣根过氧化物酶的表征
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 辣根过氧化物酶活性测定条件
• 4.3.2 辣根过氧化物酶的侧链修饰
• 4.3.3 辣根过氧化物酶的包埋
• 4.3.4 包埋辣根过氧化物酶TEM表征
• 4.3.5 包埋辣根过氧化物酶激光共聚焦分析
• 4.3.6 包埋辣根过氧化物酶SEM表征
• 4.4 小结
• 5 包埋辣根过氧化物酶在水溶液中的催化性能
• 5.1 实验材料与设备
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验设备
• 5.2 实验内容
• 5.2.1 包埋辣根过氧化物酶的制备
• 5.2.2 包埋辣根过氧化物酶催化活性
• 5.2.3 温度对包埋辣根过氧化物酶活性的影响
• 5.2.4 包埋辣根过氧化物酶的重复使用性
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 包埋酶活性测定与比较
• 5.3.2 温度对包埋酶活性的影响
• 5.3.4 包埋酶的重复使用性
• 5.3.4 包埋酶的储存稳定性
• 5.4 小结
• 6 化学因素导致辣根过氧化物酶催化性能的变化
• 6.1 实验材料与设备
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验设备
• 6.2 实验内容
• 6.2.1 不同酸碱度对酶催化性能的影响
• 6.2.2 金属离子对包埋酶催化性能的影响
• 6.2.3 变性剂对包埋酶催化性能的影响
• 6.2.4 含水量对非水介质中酶催化性能的影响
• 6.2.5 有机溶剂对包埋酶催化性能的影响
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 辣根过氧化物酶的酸碱稳定性
• 6.3.2 不同金属离子对酶催化性能的影响
• 6.3.3 变性剂对包埋酶催化性能的影响
• 6.3.4 含水量对非水介质中酶催化的影响
• 6.3.5 有机溶剂对辣根过氧化物酶催化性能的影响
• 6.4 小结
• 7 结论与建议
• 7.1 结论
• 7.2 建议
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所获得的科研成果