论文摘要
研究背景和目的:急性T淋巴细胞白血病（Acute T-cell lymphoblastic leukemia,T-ALL）是一种侵袭性较强的恶性血液肿瘤,尽管随着多药联合、大剂量化疗等治疗手段的不断改进,以及各类造血干细胞移植的应用和推广,但是该病的总体疗效和预后仍然较差。而且,很多病人在治疗过程中发生了耐药及药物的毒副作用。因此,寻求一种提高病人生存率和降低药物毒性的靶向治疗策略有着重要的意义。Notch信号通路是一条高度保守的信号通路,它在细胞的增殖、凋亡以及分化中起着很重要的作用。Notch1作为Notch家族中一个很重要的受体,在T细胞白血病的细胞生成中起着必不可少的作用。研究发现,至少有50-60%的T-ALL细胞株和患者存在着Notch1信号通路的激活,甚至由于Notch1基因的突变而导致Notch1信号通路的异常活化。小分子抑制剂γ-分泌酶抑制剂可以通过减少Notch1信号通路的转导来诱导细胞的凋亡,已经成为了治疗T-ALL的候选靶向药物之一。叉头转运因子家族3（Forkhead box protein 3 , Foxp3）,是CD4+CD25+调节T细胞（Regulatory T cells, Tregs）的特异性标志,它在T细胞的调节、激活以及分化中都起着相当重要的作用。Foxp3+Tregs不仅在维持外周免疫耐受中起着重要作用,还在肿瘤发生和发展的过程中占据重要地位。很多小鼠和人类恶性肿瘤的发病机制和侵袭力同Foxp3的表达息息相关,例如,卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等,所以Foxp3很有可能成为临床上评估恶性肿瘤预后的一个指标,甚至可以成为某些肿瘤的治疗靶点。本研究选用T细胞白血病Jurkat细胞株作为研究对象,在证实其高表达Foxp3的基础上,采用细胞培养、Real-time PCR方法、Western-blot方法、流式细胞术等多种细胞分子生物学技术,检测Notch1信号通路的抑制剂DAPT刺激Jurkat细胞后Foxp3表达的变化,观察DAPT对Jurkat细胞增殖、凋亡和分化的影响,并检测相关蛋白的变化,探讨在T淋巴细胞白血病中,Notch1信号通路是否参与调控Foxp3的表达以及如何调控,为Notch1信号通路的抑制剂作用于T细胞白血病提供有价值的实验依据,并为T细胞白血病的靶向治疗探索新的方法。研究内容和方法:第一部分Notch1、Foxp3在Jurkat细胞株中的表达和意义1、采用RT-PCR方法以及Real-time PCR方法分别对Jurkat细胞的Notch1基因和Foxp3基因进行检测,并与正常人外周血单个核细胞（PBMC）进行比较。2、采用Western-blot方法对Jurkat细胞的Notch1-Cleaved蛋白进行检测,并与正常人外周血单个核细胞（PBMC）进行比较。3、采用流式细胞仪对Jurkat细胞的Foxp3蛋白进行检测,并与正常人外周血单个核细胞（PBMC）进行比较。第二部分Notch1信号通路的抑制剂DAPT对Jurkat细胞株生物学行为的影响1、采用CCK-8法检测不同浓度的DAPT（浓度分别为1、2.5、5、10、20umol/L）在不同的时间点（4、8、12、24、48、72小时）对Jurkat细胞增殖的抑制,并在倒置显微镜下观察细胞的生长状态。2、采用Annexin V-PI双染流式细胞术检测不同浓度的DAPT（浓度分别为1、5、10、20umol/L）刺激细胞48小时后的凋亡率。3、运用瑞氏-姬姆萨染色法在油镜下观察浓度10umol/L DAPT刺激Jurkat细胞48小时后形态学的改变。4、采用GENMED通用型细胞周期流式细胞仪检测不同浓度的DAPT（浓度分别为1、5、10、20umol/L）刺激细胞48小时后对细胞周期的影响。5、采用流式细胞仪检测浓度10umol/L DAPT刺激Jurkat细胞48小时后T细胞分化抗原表达的变化。6、提取经不同浓度的DAPT（浓度分别为1、5、10、20umol/L）作用Jurkat细胞24、48、72小时的总RNA,用Real-time PCR方法检测Notch1、Hes1、Foxp3的mRNA表达情况。7、提取经不同浓度的DAPT（浓度分别为1、5、10、20umol/L）作用Jurkat细胞24、48、72小时的和蛋白,用Western-blot方法检测Notch1-Cleaved、Hes1的蛋白表达情况。8、收集经不同浓度的DAPT（浓度分别为1、5、10、20umol/L）作用48、72小时的Jurkat细胞,用流式细胞术方法检测Foxp3的蛋白表达情况。9、提取经浓度为10umol/L的DAPT作用Jurkat细胞48小时的蛋白,用Western-blot方法检测NF-κB、p-ERK1/2、STAT1的蛋白表达情况。结果:第一部分1、Jurkat细胞株高表达Notch1基因和Notch1-Cleaved蛋白,而正常人PBMC不表达,两者比较有统计学意义（P﹤0.05）。2、流式细胞仪检测Jurkat细胞的Foxp3蛋白表达量（88±2%）,而正常人PBMC Foxp3蛋白表达量较低（5±3.5%）,两者比较有统计学意义（P﹤0.05）。第二部分1、CCK-8结果显示:经各种浓度的DAPT刺激Jurkat细胞4、8、12小时后,没有出现明显的生长抑制（P﹥0.05）。在24小时开始出现抑制,且随着浓度的增加,抑制率增加,48小时的时候增殖抑制作用最强,在浓度为20umol/L的时候增殖抑制率最大,为33±2.3%（P﹤0.05）。但是在72小时的时候细胞增殖抑制能力逐渐减弱,甚至在浓度为10umol/L的时候开始出现增殖增强。光学显微镜下观察细胞形态,经DAPT刺激48小时后,随着浓度的增加,Jurkat细胞增殖有下降趋势,而且成团的细胞也有减少。2、不同浓度的DAPT刺激Jurkat细胞48小时后,用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,结果表明,DAPT可以诱导细胞凋亡,并且随着浓度的增加,细胞的总凋亡率也增加。3、瑞氏-姬姆萨染色法染色后在显微镜下观察,未加DAPT刺激的Jurkat细胞细胞膜完整,染色质分布均匀,经浓度为10umol/L DAPT刺激48小时后,可见到部分凋亡细胞,这些细胞形态有些变得不规则,体积缩小,染色质萎缩,有些可见细胞核萎缩破裂,细胞质外流。4、不同浓度的DAPT刺激Jurkat细胞48小时后,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,结果表明,DAPT刺激细胞后,G0/G1期的细胞逐渐增多,S期及G2/M期的细胞逐渐减少,并且,随着DAPT浓度的增加,这种趋势越明显,说明DAPT可以将细胞阻滞在G0/G1期。5、流式细胞仪检测,经浓度为10umol/L的DAPT刺激Jurkat细胞48小时后的T细胞分化抗原CD7表达下降,溶媒对照DMSO组为91±0.5% ,无刺激组为91±0.4% , 10umol/L的DAPT组为65±1.2%（P﹤0.05）,CD2、CD5表达强阳性,刺激前后没有变化。6、RT-PCR法检测,经浓度为1、5、10、20umol/L的DAPT刺激48小时的Jurkat细胞与没有刺激的细胞相比较,Notch1基因的表达下调,而且有着剂量依赖性。Real-Time PCR法检测,浓度为1、5、10、20umol/L的DAPT刺激Jurkat细胞48小时后,Hes1、Foxp3基因的表达水平也下调,与没有刺激的细胞相比,Hes1基因的表达分别为90.12±1.4%、57.3±2.2%、42.1±3.3%、41.8±6%（P﹤0.05）,Foxp3基因的表达分别为89±2.1%、67.3±3%、46.98±2.5%、45±3.2%（P﹤0.05）。浓度为10umol/L的DAPT刺激Jurkat细胞24、48、72小时后与没有刺激的细胞相比, Hes1基因的表达水平随时间变化出现下调,分别为53.59±12.7%、28.95±4.2%、27.35±1.4%（P﹤0.05）,而Foxp3基因的表达在72小时出现上调,分别为90.5±6.7%、46.98±2.5%、112±14%（P﹤0.05）。7、Western-blot法检测,浓度为10umol/L的DAPT刺激Jurkat细胞48小时后Notch1-Cleaved、Hes1蛋白的表达量减少, Notch1-Cleaved半定量比值（ Notch1-Cleaved/GAPDH ）为72.5±3.8% , Hes1蛋白的半定量比值（Hes1/GAPDH）为32.1±2.9%（P﹤0.05）。8、流式细胞仪检测,浓度分别为1、5、10、20umol/L的DAPT刺激Jurkat细胞48小时后Foxp3蛋白的表达随着浓度的增加而减少,表达量分别为65.5±3.5%、60.9±2.4%、58.8±2.8%、50.7±1.9%（P﹤0.05）。但是浓度为10、20umol/L的DAPT刺激Jurkat细胞72小时后Foxp3蛋白的表达反而较前增加,分别为86.8±2.5%、87±1.7%（P﹤0.05）。9、Western-blot法检测,浓度为10umol/L的DAPT刺激Jurkat细胞48小时后NF-κB、p-ERK1/2、STAT1蛋白的表达量减少,NF-κB蛋白的半定量比值（ NF-κB/GAPDH ）为48.7±1.4% , p-ERK1/2蛋白的半定量比值（p-ERK1/2/GAPDH）为50.1±2.9%,STAT1蛋白的半定量比值（STAT1/GAPDH）为68.8±3.8%（P﹤0.05）。结论:1、Notch1信号通路抑制剂DAPT对Jurkat细胞株的生长有抑制作用,并且有着时间和浓度的依赖性,同时影响Jurkat细胞的凋亡和分化。2、DAPT可剂量依赖性下调Jurkat细胞中Foxp3的表达,可能跟NF-κB、p-ERK1/2、STAT1的调控有关,表明Foxp3可能成为Notch1信号通路下游的一个重要的靶分子。3、DAPT在抗白血病方面确有一定的潜力,Foxp3可能成为治疗T细胞白血病的一个靶点。
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