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不同XR/XDH比例水平对重组酿酒酵母乙醇产量的影响

2020-12-11阅读(596)

不同XR/XDH比例水平对重组酿酒酵母乙醇产量的影响

论文摘要

目前燃料乙醇多以粮食作为原料进行生产,这既浪费了粮食资源也严格制约着生物燃料行业的可持续发展。自然界中存在丰富的纤维素类生物质,经过处理后可获得大量的木糖。曾有研究表明,酿酒酵母通过基因工程改造后可利用木糖,但由于木糖代谢基因辅酶偏好性问题而限制其产醇,这也使得木质纤维素类物质不能被有效地利用。本研究利用基因工程技术,构建了来自不同宿主的、可表达木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的表达质粒,转化酿酒酵母细胞后,研究重组子在不同XR/XDH酶活比值条件下,其木糖利用量及乙醇产量的变化,同时筛选出一株能高效产醇的重组子。本试验通过基因工程手段克隆Pichia stipitis CICC1960和Candida shehatae 20335的木糖还原酶基因（xyl1）及木糖醇脱氢酶基因（xyl2）,同时将之插入含有URA3及rDNA等元件的整合型质粒并转入Saccharomyces cerevisiae W5中,获得四种含有不同木糖代谢基因组合的重组子,分别命名为SUN-Ⅰ（P.stipits CICC1960,xyl1 及 xyl2）、SUN-Ⅱ（C.shehatae 20335,xyl1 及 xyl2）、SUN-Ⅲ（C.shehatae 20335,xyl1;P.stipitis CICC1960,xyl2）、SUN-Ⅳ（P.stipitis CICC1960,xyl1;C.shehatae 20335,xyl2）。利用G418抗性对上述四种重组子进行高拷贝筛选工作,每种随机选取10株分别进行酶活及发酵验证。结果表明,四种不同基因来源的重组子随着XR/XDH比例的变化,其自身发酵性能也呈现不同的趋势。试验数据显示,SUN-Ⅰ的XR/XDH比值在0.003～0.037时有利于乙醇的生成,同时XR基因所利用的NADH及NADPH两种辅因子活性比值（NADH/NADPH）在2.056～3.643时对乙醇的生成具有促进作用,其中SUN-Ⅰ-9号发酵木糖产乙醇得率最高为0.06 g/g;SUN-Ⅱ的XR/XDH比值在0.013～0.076时有利于乙醇的生成,同时NADH/NADPH比值在2.250～5.073时对乙醇的生成具有促进作用,其中SUN-Ⅱ-8号木糖发酵产乙醇得率最高为0.09 g/g;SUN-Ⅲ的XR/XDH比值在0.004～0.022时有利于乙醇的生成,同时NADH/NADPH 比值在5.190～8.386时对乙醇的生成具有促进作用,其中SUN-Ⅲ-2号木糖发酵产乙醇得率最高为0.06 g/g,同时该种重组子的木糖利用率较高,最高可达10.7g/L,约占木糖利用率约为50.4%。SUN-Ⅳ的XR/XDH比例在0.049～0.109时有利于乙醇的生成,同时NADH/NADPH 比值在0.714～1.860时对乙醇的生成具有促进作用,其中SUN-Ⅳ-1号木糖发酵产乙醇得率最高可达0.09 g/g。此外本试验还发现,SUN-Ⅳ组别的重组子乙醇得率较高,可能该种基因组合方式更适合重组子乙醇的形成。发酵罐发酵结果显示,在双碳源条件下产醇量最高的SUN-Ⅳ-1号重组子在30℃、300rpm罐体条件下乙醇得率最高可达0.54g/g。结论,除XR/XDH比例可影响重组子的乙醇产率外,NADH/NADPH比例的变化同样可对重组子的木糖利用率和乙醇代谢流的流向产生影响;高NADH亲和性的XR可增加重组子的木糖利用率,低NADH亲和性的XR可使重组子更倾向于乙醇的生成;同时NADH/NADPH比例的差异也直接影响XR/XDH的最适比例。本研究在成功的构建了含有同源及异源木糖代谢基因组合的S.cerevisiae重组子的同时,对不同重组子分别进行了辅酶偏好性的研究,这为后续重组菌株XR/XDH的改良奠定了一定的基础,也为研究异源木糖基因的表达提供了一定的理论依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 木质纤维素概述
  • 1.1.1 木质纤维素的类型和特点
  • 1.1.2 木质纤维素原料生产燃料乙醇的重大意义
  • 1.2 国内外燃料乙醇的发展现状
  • 1.3 酵母菌的木糖代谢途径
  • 1.4 酿酒酵母工程菌的研究进展
  • 1.4.1 引入xyl1及xyl2基因
  • 1.4.2 引入XI基因
  • 1.4.3 过表达XK基因
  • 1.4.4 下游途径的改造
  • 1.5 本实验的目的与意义
  • 1.6 课题资助名称
  • 第2章 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 菌株和质粒
  • 2.1.2 扩增引物
  • 2.1.3 培养基
  • 2.1.4 分子试剂、酶及试剂盒
  • 2.1.5 主要缓冲液及试剂配制
  • 2.1.6 主要实验仪器设备
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 xyl1和xyl2基因克隆及序列分析
  • 2.2.2 整合型质粒pAK-xyl1-4及p-AKRX2-2的构建
  • 2.2.3 重组质粒限制性内切酶酶切图谱分析
  • 2.2.4 酿酒酵母重组子的构建
  • 2.2.5 重组子的验证及高拷贝菌株的筛选
  • 2.2.6 重组子蛋白质含量的测定
  • 2.2.7 重组子酶活与辅酶比的测定
  • 2.2.8 重组子发酵试验
  • 第3章 结果与分析
  • 3.1 xyl1和xyl2基因亚克隆及序列分析
  • 3.1.1 P.stipitis CICC1960基因组DNA的提取
  • 3.1.2 xyl1及xyl2基因PCR验证
  • 3.1.3 pTSUN-xyl1、pTSUN-xyl2质粒的筛选验证
  • 3.1.4 xyl1及xyl2克隆测序及生物信息学分析
  • 3.2 酵母整合型表达载体pAK-xyl1-4及p-AKRX2-2的构建
  • 3.2.1 骨架质粒胶回收
  • 3.2.2 目的基因胶回收
  • 3.2.3 重组质粒酶切及PCR验证
  • 3.3 重组质粒限制性内切酶酶切图谱分析
  • 3.3.1 pAK-xyl1质粒mapping分析
  • 3.3.2 pAK-xyl1-4质粒mapping分析
  • 3.3.3 p-AKRX质粒mapping分析
  • 3.3.4 p-AKRX2-2质粒mapping分析
  • 3.4 重组质粒转化酿酒酵母
  • 3.4.1 质粒线性化
  • 3.4.2 重组子筛选及验证
  • 3.5 重组子蛋白质含量、酶活测定
  • 3.5.1 蛋白质含量测定
  • 3.5.2 木糖还原酶酶活测定
  • 3.5.3 木糖醇脱氢酶酶活测定
  • 3.5.4 重组子XR/XDH 比例测定
  • 3.6 重组子碳源发酵利用试验结果
  • 3.6.1 葡萄糖、木糖单碳源发酵利用试验结果
  • 3.6.2 重组子木糖、葡萄糖混合碳源发酵试验
  • 3.7 重组子罐体发酵试验
  • 3.7.1 菌体OD和干重关系曲线测定
  • 3.7.2 HPLC检测
  • 第4章 讨论
  • 4.1 目的基因测序结果分析
  • 4.2 限制性内切酶酶切图谱结果分析
  • 4.3 重组子抗性筛选结果分析
  • 4.4 酶活测定结果分析
  • 4.4.1 XR酶活测定结果分析
  • 4.4.2 XDH酶活测定结果分析
  • 4.4.3 XR/XDH比例测定结果分析
  • 4.5 发酵结果分析
  • 4.5.1 葡萄糖摇瓶发酵结果分析
  • 4.5.2 木糖摇瓶发酵结果分析
  • 4.5.3 双碳源摇瓶发酵结果分析
  • 4.5.4 罐体发酵结果分析
  • 第5章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表论文

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