荧光原位杂交技术在大白菜染色体基因定位中的应用研究

论文摘要

大白菜不仅是起源于中国的重要的蔬菜作物,而且是多国芸薹属基因组计划的主要研究对象之一。基因定位是基因鉴定、克隆和利用的基础和前提。在分子细胞遗传学研究领域,利用非整倍体材料和荧光原位杂交技术手段进行基因的物理定位,日益成为基因定位研究的热点,这对物理图谱的绘制、建立遗传连锁群和特定染色体的对应关系以及遗传图谱和物理图谱的整合具有重要的意义。本研究以大白菜二倍体和本课题组创制的一套大白菜初级三体为材料,采用染色体核型分析的方法对继代繁殖多代的不同三体和二倍体的遗传稳定性进行了细胞学鉴定,采用FISH技术对两个rDNA重复序列基因和通过PCR扩增、克隆获得的几个功能基因片段进行了物理定位。主要研究结果如下: 1.通过对FISH的相关技术参数的研究,建立了大白菜染色体制备和制片预处理、探针杂交、杂交后洗脱以及信号检测的技术体系。以重复序列45S rDNA为探针,利用该体系在大白菜中期和间期染色体上成功检出了10个荧光强度强弱不同的杂交信号,为荧光原位杂交技术在大白菜上的利用奠定了基础。以幼嫩子叶为材料,采用低温刀切的方法,改进了fiber-FISH技术过程中细胞核的提取方法,成功的制备出了平滑伸展的DNA纤维,大白菜基因组探针在DNA纤维上杂交,杂交信号为非连续的念珠状长链。 2.核型分析表明,大白菜染色体核型公式为2n=2x=20=10m+8sm+2st（SAT）,核型类型为2B。1号、2号、4号、5号、7号为中部着丝点染色体;3号、6号、8号、9号染色体为近中部着丝点染色体;10号染色体为近端部着丝点染色体。DAPI显带结果表明深染区多集中在着丝粒两侧附近,同源染色体的带纹数目、分布位置基本一致。 3.通过对大白菜组培苗根尖细胞有丝分裂染色体数目观察,发现长期继代保存的一些材料存在着染色体数目的变异;但对不同三体进行核型分析可知,染色体数目未变异的三体株系仍为最初确定的三体,没有发生染色体的置换。 4.拟南芥25S rDNA在二倍体大白菜中期染色体上的FISH定位表明存在着5个25S rDNA的同源区段,它们分别位于1号、2号、3号、4号和10号五对染色体上,杂交信号在不同染色体上的荧光强度不同。利用DNA fiber-FISH技术确定了25S rDNA在大白菜基因组中的拷贝数约为566±137。但25S rDNA在大白菜不同初级三体上检出的杂交信号的个数在7-12个之间变化,分布于4-7个同源区段上。综合分析可以看出,在不同三体的1～4号染色体的长臂及10号染色体的随体（包括次缢痕处）上均存在相应的25S rDNA的同源区段,但杂交信号在不同三体同一染色体上检出的频率不同,荧光信号强度也有变化,最强的信号出现在不同三体的#10随体染色体上（triplo4,triplo5除外）。 5.5S rDNA在二倍体大白菜检出了6个杂交信号,分别位于2号染色体的长臂、9号和10号染色体的短臂三对同源染色体上;在triplo2、triplo3和triplo9

论文目录

• 引言
• 1 芸薹属作物分子标记和基因组研究进展
• 1.1 芸薹属作物分子遗传图谱的构建
• 1.2 芸薹属作物利用分子标记进行的基因定位研究
• 1.3 芸薹属作物的比较基因组研究
• 1.4 芸薹属作物的亲缘关系与进化研究
• 2 荧光原位杂交技术及其发展
• 2.1 FISH技术发展过程中杂交分辨率的变化
• 2.2 提高低（单）拷贝DNA序列FISH灵敏度的几种方法
• 2.3 荧光原位杂交技术的几种衍生技术
• 3 重复序列在芸薹属作物上的研究
• 4 本项研究的背景、内容和目的
• 第一章 大白菜FISH技术体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.2.2 供试探针
• 1.2.3 试剂盒
• 1.2.4 常用储液配制
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 根尖中期染色体制片
• 1.2.2 DNA纤维制片
• 1.2.3 探针的标记、标记效果的检测与纯化
• 1.2.4 荧光原位杂交技术参数的筛选
• 1.2.5 染色体原位杂交及信号检测程序
• 1.2.6 DNA纤维原位杂交及信号检测
• 2 结果与分析
• 2.1 大白菜染色体制片技术体系的建立
• 2.1.1 两种染色体制片技术效果比较
• 2.1.2 酶解去壁低渗法制片过程中相关因子的研究
• 2.1.3 酶解去壁低渗法制片技术流程的建立
• 2.2 探针标记效率的检测
• 2.3 大白菜荧光原位杂交体系的建立
• 2.3.1 荧光原位杂交技术参数的筛选结果
• 2.3.2 大白菜FISH杂交体系的建立
• 2.3.3 45S rDNA在大白菜和甘蓝染色体上的杂交
• 2.4 细胞核及伸展DNA纤维质量的检查
• 2.4.1 细胞核的提取
• 2.4.2 DNA纤维标本的制备
• 2.4.3 基因组DNA做探针对基因组DNA纤维杂交
• 3 讨论
• 3.1 关于染色体制片技术的探讨
• 3.2 酶解去壁低渗法制片过程中应注意的两个因素
• 3.3 对荧光原位杂交技术的几点讨论
• 3.3.1 探针的标记和杂交液中的浓度
• 3.3.2 变性处理和杂交时间
• 3.3.3 杂交后洗脱
• 3.4 对DNA fiber-FISH技术的探索
• 3.4.1 细胞核悬液的制备
• 3.4.2 DNA纤维的制备
• 3.4.3 fiber-FISH荧光信号的特点
• 3.4.4 在大白菜上建立fiber-FISH技术体系的意义
• 第二章 rDNA在大白菜二倍体和初级三体的染色体定位
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 供试探针
• 1.1.3 常用储液配制
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 根尖中期染色体制片
• 1.2.2 核型分析
• 1.2.3 质粒DNA的提取
• 1.2.4 探针标记、纯化与标记效果的检测
• 1.2.5 染色体荧光原位杂交和信号检测
• 1.2.6 DNA纤维原位杂交及信号检测
• 2 结果与分析
• 2.1 大白菜有丝分裂中期不同染色体的确定
• 2.1.1 大白菜二倍体有丝分裂中期染色体形态图
• 2.1.2 大白菜前中期染色体的DAPI显带
• 2.2 大白菜不同初级三体组培苗核型分析
• 2.2.1 大白菜组培苗株系染色体数目的鉴定
• 2.2.2 大白菜三体组培苗株系核型分析
• 2.3 25S rDNA在大白菜二倍体和初级三体上的定位
• 2.3.1 25S rDNA在大白菜二倍体上的定位结果
• 2.3.2 25S rDNA在大白菜不同初级三体上的定位结果
• 2.4 5S rDNA在大白菜二倍体和初级三体上的定位
• 3 讨论
• 3.1 rDNA基因在大白菜二倍体染色体上定位的两点探讨
• 3.1.1 关于rDNA的杂交信号与随体的关系
• 3.1 2 关于rDNA信号位点的位置与异染色质的关系
• 3.2 rDNA在大白菜不同三体染色体上位点的多态性
• 3.3 rDNA在芸薹属的核型分析和大白菜染色体识别中的应用
• 第三章 大白菜功能基因片段的克隆与部分基因的定位
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒载体
• 1.1.3 各种酶类
• 1.1.4 试剂盒
• 1.1.5 常用储液配制
• 1.1.6 白菜类作物功能基因的确定
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 材料的准备
• 1.2.2 基因组DNA的提取和检测
• 1.2.3 引物设计、合成与PCR扩增
• 1.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 1.2.5 大肠杆菌DH5a感受态的制备
• 1.2.6 PCR产物的克隆
• 1.2.7 单克隆菌体的鉴定
• 1.2.8 测序
• 1.2.9 探针的获得
• 1.2.10 探针的标记、标记效率的检测与标记探针的纯化
• 1.2.11 染色体制片
• 1.2.12 荧光原位杂交
• 2.结果与分析
• 2.1 大白菜基因组DNA质量的检测
• 2.2 各基因探针的扩增、克隆与测序结果
• 2.2.1 PCR条件的优化
• 2.2.2 质粒DNA的转化
• 2.2.3 单菌落PCR鉴定结果
• 1409基因克隆等14个PCR产物测序鉴定结果'>2.2.4 EPSP₁₄₀₉基因克隆等14个PCR产物测序鉴定结果
• 1409、RGA₉₄₄、RPS2₆₇₁、CYP₉₅₄四个基因片段的序列分析'>2.3 EPSP₁₄₀₉、RGA₉₄₄、RPS2₆₇₁、CYP₉₅₄四个基因片段的序列分析
• 1409基因片段的序列分析'>2.3.1 EPSP₁₄₀₉基因片段的序列分析
• 944基因片段的序列分析'>2.3.2 RGA₉₄₄基因片段的序列分析
• 671基因片段的序列分析'>2.3.3 RPS2₆₇₁基因片段的序列分析
• 954基因片段的序列分析'>2.3.4 CYP₉₅₄基因片段的序列分析
• 1409、RGA₉₄₄、RPS2₆₇₁、CYP₉₅₄四个基因在大白菜染色体上的定位'>2.4 EPSP₁₄₀₉、RGA₉₄₄、RPS2₆₇₁、CYP₉₅₄四个基因在大白菜染色体上的定位
• 3 讨论
• 3.1 白菜类作物功能基因在大白菜上的克隆和分离
• 3.2 单低拷贝基因的定位技术探讨
• 结论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C
• 发表的论文
• 作者简介
• 致谢