苏云金芽孢杆菌FS140菌株蛋白酶的研究

论文摘要

在55℃条件下,从35株苏云金芽孢杆菌中筛选到一株高产耐热蛋白酶菌株FS140。首先进行发酵培养基优化,通过单因素筛选确定最佳碳源为葡萄糖,氮源为酵母粉+豆饼粉;采用二水平Plackett-Burman设计对影响产酶的8因素进行显著性筛选,获得培养基成分中3个重要影响因子:黄豆饼粉、酵母粉、葡萄糖;运用响应面分析法对该3因素进行3水平优化,获得它们的最优组合:黄豆饼粉1.8%,酵母粉0.36%,葡萄糖0.14%,优化后产酶水平达到837.71U/mL,与响应面数学模型的预测值只有1.34%的误差。发酵条件优化结果表明为:发酵温度为31℃,发酵初始pH为7.0,摇瓶装量为为35mL/250mL三角瓶,每瓶的接种量为0.75mL菌悬液（细胞浓度为7×106个/mL）,发酵22h,最终产酶水平在918.91U/mL。对苏云金芽孢杆菌FS140蛋白酶分批发酵的代谢特性进行了研究。首先描述了FS140分批发酵过程中细胞生长、产物积累、糖消耗的变化规律。基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,建立了苏云金芽孢杆菌蛋白酶发酵过程细胞生长、产物合成及基质消耗随时间变化的数学模型。动力学模型计算值结果与实验值拟合良好,较好反映了苏云金芽孢杆菌分批发酵过程的动力学特征。从糖代谢角度分析FS140蛋白酶发酵过程,葡萄糖对整个发酵过程是一个限制底物,而发酵液pH的变化能够反映葡萄糖代谢过程。该参数在7L自动发酵罐容易在线检测,因此确定了pH控制的葡萄糖流加方案。结果表明:总糖发酵水平由5g/L提高到7.86g/L,产酶水平也由1010U/mL提高到1211U/mL。采用盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析与Sephacryl S-200分子筛柱层析等纯化步骤对该酶进行了初步纯化。酶纯化了12.8倍,比活力达到29900U/mg,纯化收率为28.6%。通过SDS-PAGE电泳,测定该酶蛋白分子量为为40.0kDa。酶学特性研究结果表明:酶最适作用温度为55℃,在50℃以下有较好的热稳定性,最适作用pH为7.0,稳定pH范围为7-11。酶催化水解酪蛋白、牛血红蛋白、牛血清白蛋白三种底物,酶促反应符合米氏方程,Km分别为0.5、1.05、1.28g/L,Vmax分别为333.3、500、312.5ug/min/mL,酪蛋白为其最适底物。金属离子对酶活力影响研究结果表明:终浓度为5mmol/L下,一价的Na+、K+和Li+对酶活性没有影响;终浓度为3mmol/L下,二价Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ba2+对酶活性没有影响,二价的Cu2+、Hg2+、Pb2+、Zn2+对酶有较大的抑制作用,残余酶活仅为对照的32.4%、35.5%、43.5%和67.2%,二价的Fe2+具备较强的激活效应,残余酶活达到对照的140.5%。终浓度为3mmol/L下,三价Fe3+具有激活作用,残余酶活达到对照的119.4%、Al3+对于酶活有较强的抑制作用,残余酶活仅为对照的58.5%。甲醇、1.2-丙二醇、乙醇与异丙醇4种有机溶剂对酶活力的抑制作用是随其浓度的升高而增大,IC50（酶活力下降50%的抑制剂浓度）分别为:15.5%、14.5%、8.5%与6.8%。采用10种化学修饰剂对蛋白酶进行化学修饰,结果表明组氨酸与色氨酸是活性中心必需氨基酸。EDTA对酶活性有强烈的抑制作用,表明该酶是典型的金属蛋白酶。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 蛋白酶的分类
• 2 微生物蛋白酶
• 2.1 微生物作为蛋白酶来源的优越性
• 2.2 细菌来源的蛋白酶
• 2.3 霉菌来源的蛋白酶
• 2.4 酵母来源的蛋白酶
• 2.5 放线菌来源的蛋白酶
• 2.6 病毒来源的蛋白酶
• 3 苏云金芽孢杆菌蛋白酶
• 3.1 苏云金芽孢杆菌概述
• 3.2 苏云金芽孢杆菌产生酶类
• 3.3 苏云金芽孢杆菌蛋白酶
• 3.3.1 基本概况
• 3.3.2 影响蛋白酶产生的因素
• 3.3.3 蛋白酶对Bt毒性影响
• 4 蛋白酶工业生产
• 4.1 蛋白酶的生产菌种
• 4.2 蛋白酶发酵工艺条件及控制
• 4.2.1 培养基
• 4.2.2 培养条件对产酶的影响
• 4.2.3 发酵控制对产酶的影响
• 4.3 发酵优化的试验设计
• 4.3.1 正交设计
• 4.3.2 均匀设计
• 4.3.3 本研究试验设计依据
• 4.4 数学统计软件
• 4.4.1 SAS软件
• 4.4.2 Origin软件
• 5 发酵动力学模型的构建
• 6 蛋白酶的纯化与酶学特性
• 6.1 蛋白酶的纯化
• 6.2 蛋白酶特性
• 7 酶侧链基团化学修饰
• 8 研究的意义与目的
• 第1章 Bt耐热蛋白酶的菌株筛选与生理生化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 药品与试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶活测定
• 1.2.2 菌株筛选
• 1.2.3 镜检
• 1.2.4 生理生化反应
• 2 结果与分析
• 2.1 产耐温蛋白酶Bt菌株的筛选
• 2.2 FS140培养特征与生理生化
• 3 小结与讨论
• 第2章 BtFS140产耐温蛋白酶发酵条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶活力测定
• 1.2.2 液体发酵条件
• 1.2.3 发酵培养基优化
• 1.2.4 发酵培养条件的优化
• 2 结果与分析
• 2.1 单因素实验
• 2.2 Plackett-Burman设计筛选产酶重要影响因子
• 2.3 响应面分析（RSM）优化培养基组成
• 2.4 发酵条件的优化
• 3 小结与讨论
• 第3章 Bt140蛋白酶发酵动力学模型的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 液体发酵条件
• 1.2.2 分析测定
• 1.2.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 蛋白酶发酵过程代谢变化特征
• 2.2 细胞生长动力学模型
• 2.3 蛋白酶合成动力学模型
• 2.4 基质消耗动力学模型
• 2.5 模型验证
• 3 小结与讨论
• 第4章 蛋白酶补料发酵初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 液体摇瓶发酵条件
• 1.2.2 种子培养液的制备
• 1.2.3 7L自动罐发酵条件
• 1.2.4 分析测定
• 2 结果与分析
• 2.1 摇瓶分批发酵
• 2.2 7L自动罐分批发酵
• 2.3 pH控制发酵
• 2.4 葡萄糖补料分批发酵
• 3 小结与讨论
• 第5章 蛋白酶分离纯化与性质的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 主要试剂与药品
• 1.1.2 缓冲液
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶活力与比活力的测定
• 1.2.2 蛋白质浓度测定
• 1.2.3 酶的分离纯化
• 1.2.4 SDS-PAGE
• 1.2.5 蛋白质分子量测定
• 1.2.6 酶分子的紫外吸收光谱测定
• 1.2.7 酶分子的内源荧光光谱测定
• 1.2.8 酶催化反应的动力学性质研究
• 1.2.9 金属离子对酶活力的影响
• 1.2.10 有机溶剂对酶促反应的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 酶的分离纯化
• 2.2 酶的理化特性
• 2.3 酶催化反应的动力学性质研究
• 2.4 金属离子对酶活力的影响
• 2.5 有机溶剂对酶促反应的影响
• 3 小结与讨论
• 第6章 蛋白酶化学修饰与活性中心的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 主要试剂与药品
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶活力的测定
• 1.2.2 酶分子的紫外吸收光谱的测定
• 1.2.4 蛋白酶的化学修饰
• 1.2.5 EDTA对酶活力的影响
• 1.2.6 不同金属离子对被EDTA抑制的酶的活力影响
• 2 结果与分析
• 2.1 赖氨酸ε-氨基的化学修饰
• 2.2 丝氨酸羰基的化学修饰
• 2.3 半胱氨酸巯基的化学修饰
• 2.4 精氨酸胍基的化学修饰
• 2.5 酪氨酸酚羟基的化学修饰
• 2.6 组氨酸酚咪唑基的化学修饰
• 2.7 色氨酸吲哚基的化学修饰
• 2.8 蛋氨酸硫醚基的化学修饰
• 2.9 二硫键的化学修饰
• 2.10 EDTA对酶活力的影响
• 2.11 不同金属离子对被EDTA抑制的酶的活力影响
• 3 小结与讨论
• 第7章 总结
• 1 主要研究结果
• 2 创新点
• 3 下一步研究内容
• 参考文献
• 附录1 博士期间发表（或投稿）论文
• 致谢