猪Ghrelin基因的克隆、原核表达及Ghrelin蛋白多克隆抗体的制备研究

论文摘要

Ghrelin是由28个氨基酸组成的第一个生长激素促分泌素受体的内源性配体,最早是由Kojima等在小鼠和人的胃内分泌细胞及下丘脑弓状核中发现的。因其具有促进垂体前叶生长激素的分泌的作用而命名为Ghrelin。Ghrelin是目前为止除了生长激素释放激素和生长抑素外,第二个调节生长激素分泌的内源性物质。Ghrelin主要合成于胃和肠,垂体、下丘脑、胎盘、肾脏和胰腺等亦有少量合成。根据现有的资料分析,Ghrelin除调节生长激素分泌外,还有增加食欲,调节能量平衡,促进胃酸分泌等作用。根据Genbank中检索猪prepro ghrelin mRNA序列,设计了猪Ghrelin原核表达引物。通过RT-PCR技术扩增猪的Ghrelin cDNA,将其与pMD18-TVector连接,转化入大肠杆菌经鉴定正确后,回收目的片段与原核表达载体pET28a（+）相连接,构建了猪Ghrelin的原核表达系统,获得了重组菌分泌的猪Ghrelin原核表达多肽。以纯化的包涵体蛋白与不完全福氏佐剂氢氧化铝佐剂混合研磨均匀后免疫新西兰大白兔,获取了兔抗猪Ghrelin免疫血清,经Western-blot方法检测,获得了猪Ghrelin的多克隆抗体。这些研究将为Ghrelin各方面进一步的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表
• 前言
• 1 Ghrelin的发现
• 2 Ghrelin的分布、结构及功能
• 2.1 Ghrelin的合成与分布
• 2.2 结构与功能
• 3.Ghrelin受体分布
• 4.Ghrelin的生物学作用
• 4.1 特异性刺激垂体前叶生长激素的释放
• 4.2 增加食欲、调节能量代谢
• 4.3 GhreIin对胃肠道功能的影响
• 4.4.Ghrelin对心脏功能的影响
• 4.5.增强机体免疫力与抗应激能力
• 4.6.其他作用
• 试验目的和意义
• 试验一 猪Ghrelin基因的克隆和原核表达
• 材料
• 1 试验材料
• 2.酶与试剂
• 3.溶液及培养基配制
• 4.主要仪器
• 方法
• 1.引物设计与合成
• 2.GhreIin cDNA的克隆
• 2.1 胃组织总RNA的提取
• 2.2.RNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.RT-PCR反应
• 2.4.PCR反应
• 2.5.DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.6.DNA片段的回收
• 3.DNA片段的连接
• 3.1.连接酶连接DNA片段
• 3.2 载体DNA的酶切反应
• 3.3 目的基因与质粒载体的连接反应
• 3.4.感受态的制备
• 4.质粒的转化
• 4.1 质粒的小量提取
• 4.2 克隆载体的鉴定
• 4.3.序列测定
• 5.pGhrelin原核表达质粒的构建
• 21中的表达'>5.1.pGhrelin在大肠杆菌BL₂₁中的表达
• 5.2.表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 5.2.1.SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制
• 5.2.2 蛋白质样品的上样前处理及电泳
• 5.2.3 凝胶的染色与脱色
• 结果
• 1.猪胃总RNA的提取结果
• 2.pGhreIin cDNA片段的RT-PCR扩增结果
• 3.pGhreIin克隆载体的构建
• 3.1 PCR产物克隆
• 3.2.克隆质粒的酶切鉴定
• 3.3 克隆质粒的PCR鉴定
• 4.表达载体与目的基因的连接与转化
• 4.1 质粒酶切鉴定
• 4.2 质粒PCR鉴定
• 5.重组基因的诱导表达
• 讨论
• 小结
• 试验二 猪Ghrelin蛋白多克隆抗体的制备
• 材料
• 1.试验动物及免疫原
• 2.主要试剂
• 3 主要仪器设备
• 4.相关配制试剂
• 4.1 蛋白电泳相关试剂
• 4.2 Western blot试剂
• 4.3 Buffer A配方
• 方法
• 1.Ghrelin包涵体的提取
• 2 动物免疫
• 3.抗体的纯化与检测
• 3.1 抗体纯化
• 3.2 Western blot检测
• 结果
• 1.Ghrelin包涵体蛋白多克隆抗体
• 2.Western-blot检测Ghrelin包涵体蛋白多克隆抗体特异性
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢