阳离子白蛋白结合聚乙二醇-聚乳酸纳米粒的脑内递药研究

论文题目: 阳离子白蛋白结合聚乙二醇-聚乳酸纳米粒的脑内递药研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 药剂学

作者: 陆伟

导师: 蒋新国

关键词: 阳离子白蛋白,纳米粒,血脑屏障,脑内递送,香豆素,基因治疗,阿克拉霉素

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 机体的血脑屏障（BBB）限制了化学药物、多肽蛋白和基因药物的脑内转运。因此,提高药物脑内传递技术的研究,尤其是具有脑内靶向性的新型药物传递系统的构建,正成为药剂学的研究热点。以非侵袭性给药途径提高药物脑内传递的研究,已成为国内外脑内靶向给药的研究重点。其中,采用酯化、化学传递系统和载体介导转运方式增加药物分子脑内摄取的方法,需要将药物直接进行化学修饰,对药物的理化性质要求高。采用小鼠抗大鼠转铁蛋白受体单克隆抗体作为靶向头基,可以介导与其连接的载药系统如脂质体以受体介导胞吞转运方式入脑。但必须通过基因工程技术制备人源化的嵌合抗体,制备技术较为复杂。 为了克服以上缺陷,本课题构建一种新型的脑内靶向递释系统—阳离子化白蛋白结合纳米粒给药系统（CBSA-NP）。该纳米粒可经表面阳离子化白蛋白以吸附介导胞吞转运方式增加其脑内转运;将纳米粒作为药物的载体,可显著提高药物输送能力;纳米粒采用复乳/溶媒蒸发法制备,适合于包载水溶性大分子药物,如大分子蛋白多肽和基因药物,可以掩盖其自身的理化性质,代之以纳米粒的特性;可以减少或避免药物的体内迅速降解;纳米粒表面经PEG修饰,可避免单核巨噬系统的吞噬,延长在血浆中的半衰期,提高血浆药时曲线下面积（AUC）,具有隐形作用。 本文第一部份为CBSA-NP的构建和表征,它是由复乳/溶媒蒸发法制备马来酰亚胺—聚乙二醇（PEG-Maleimide）和甲氧基聚乙二醇（MPEG）表面共修饰的聚乳酸（PLA）纳米粒,表面经PEG—Maleimide与巯基化的阳离子白蛋白共价连接而构成。该纳米粒的平均数均粒径在100nm以下,Zeta电位为-10mV左右。经X射线光电子能谱和免疫电镜实验证实纳米粒表面连接有CBSA。利用同位素技术测得Maleimide-PEG-PLA与MPEG-PLA的比例为1:20,1:10和1:5时纳米粒表面连接的CBSA数目分别为33.2,109.9和372.0。 为了评价CBSA-NP的脑内传递特性和毒性,本文第二部分建立了大鼠脑毛细血管内皮细胞（BCEC）和星形胶质细胞共培养的体外BBB模型。扫描电镜和透射电镜的观察结果显示,该模型中BCEC可形成紧密连接,星形胶质细胞的突起穿过膜孔与BCEC相接触,形态学符合要求。该模型的跨内皮细胞电阻值为313±23Ω·cm2,14C-蔗糖的渗透系数为0.94×10-3cm/min,与文献报道相吻。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

前言

第一部分 阳离子白蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸纳米粒的构建和表征

1 仪器和材料

1.1 仪器

1.2 材料和试剂

2 实验方法

2.1 纳米粒聚合物材料的选择、合成和表征

2.2 PEG化纳米粒的制备

2.3 CBSA的制备和鉴定

2.4 CBSA的巯基化

2.5 CBSA-NP的制备

2.6 CBSA-NP的表征

3 实验结果

3.1 MPEG-PLA和Maleimide-PEG-PLA的表征

3.2 CBSA的鉴定

3.3 粒径及Zeta电位

3.4 表面元素分析

3.5 CBSA-NP的免疫电镜染色

3.6 纳米粒的CBSA结合数

4 讨论

4.1 CBSA-NP制备工艺的选择

4.2 CBSA-NP的粒径和Zeta电位

5 小结

第二部分 体外血脑屏障模型的建立

1 仪器和材料

1.1 仪器

1.2 材料和试剂

1.3 实验动物

2 实验方法

2.1 大鼠BCEC的培养和鉴定

2.2 大鼠星形胶质细胞的培养和鉴定

2.3 大鼠BCEC和星形胶质细胞共培养模型的制备

2.4 共培养模型的鉴定

3 实验结果

3.1 大鼠BCEC的培养和鉴定

3.2 大鼠星形胶质细胞的培养和鉴定

3.3 大鼠BCEC和星形胶质细胞共培养模型的鉴定

3.4 跨内皮细胞电阻值的测定

3.5 ~(14)C-蔗糖的渗透系数的测定

4 讨论

4.1 BCEC的原代培养

4.2 星形胶质细胞的原代培养

4.3 影响共培养模型内皮细胞形成致密单层的因素

5 小结

第三部分 阳离子白蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸纳米粒脑内递药特性及毒性的体外评价

1 仪器和试剂

1.1 仪器

1.2 材料和试剂

2 实验方法

2.1 6-香豆素体外HPLC分析方法的建立

2.2 载6-香豆素荧光探针的CBSA-NP和BSA-NP的制备和表征

2.3 6-香豆素的体外泄漏试验

2.4 大鼠BCEC摄取载6-香豆素的CBSA-NP和BSA-NP的定性观察

2.5 大鼠BCEC摄取载6-香豆素CBSA-NP和BSA-NP的定量分析

2.6 载6-香豆素CBSA-NP和BSA-NP的体外BBB渗透系数

2.7 CBSA-NP的体外毒性考察

3 实验结果

3.1 6-香豆素体外HPLC分析方法的建立

3.2 载6-香豆素的CBSA-NP和BSA-NP的制备及表征

3.3 6-香豆素的体外泄漏试验

3.4 大鼠BCEC摄取载6-香豆素的CBSA-NP和BSA-NP的定性观察

3.5 大鼠BCEC摄取载6-香豆素的CBSA-NP和BSA-NP的定量实验

3.6 体外BBB渗透系数

3.7 CBSA-NP对BCEC的细胞毒性

3.8 纳米粒对~(14)C-蔗糖渗透系数的影响

4 讨论

4.1 CBSA-NP脑内递药特性的体外评价

4.2 CBSA-NP的体外毒性

5 小结

第四部分 阳离子白蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸纳米粒脑内递药特性及毒性的体内评价

1 仪器和试剂

1.1 仪器

1.2 材料和试剂

1.3 实验动物

2 实验方法

2.1 6-香豆素体内HPLC分析方法的建立

2.2 纳米粒在小鼠大脑和血中的药动学

2.3 载6-香豆素CBSA-NP和BSA-NP的脑组织分布观察

2.4 CD 68免疫组化染色

3 实验结果

3.1 6-香豆素体内HPLC分析方法的建立

3.2 载6-香豆素CBSA-NP和NP在小鼠大脑和血中的药动学

3.3 载6-香豆素CBSA-NP和BSA-NP在小鼠脑内的分布

3.4 CD 68免疫组化染色

4 讨论

4.1 CBSA-NP脑内特异性转运的机理

4.2 对CBSA-NP脑内特异性转运的处方优化

5 小结

第五部分 阳离子白蛋白结合聚乙醇—聚乳酸纳米粒介导hTRAIL基因靶向性治疗胶质瘤

1 仪器和试剂

1.1 仪器

1.2 材料和试剂

1.3 实验动物

2 实验方法

2.1 CBSA-NP-hTRAIL基因治疗系统的制备和表征

2.2 CBSA-NP的胞吞机制

2.3 CBSA-NP介导hTRAIL基因传递的细胞内示踪

2.4 C6细胞体外转染和凋亡检测

2.5 原位杂交检测脑内hTRAIL mRNA的特异性表达

2.6 免疫荧光染色检测脑内hTRAIL蛋白的特异性表达

2.7 CBSA-NP介导TRAIL基因对胶质瘤的靶向性治疗

3 结果

3.1 CBSA-NP-hTRAIL基因治疗系统的表征

3.2 琼脂糖凝胶电泳

3.3 纳米粒的摄取机制

3.4 CBSA-NP介导hTRAIL基因传递的细胞内示踪

3.5 体外转染和凋亡检测

3.6 脑内hTRAIL mRNA的特异性表达

3.7 CBSA-NP-hTRAIL实现脑内hTRAIL蛋白的表达

3.8 CBSA-NP-hTRAIL诱导C6胶质瘤细胞的凋亡

4 讨论

4.1 CBSA-NP介导基因胞内输送的机理——内体—溶酶体逃脱

4.2 CBSA-NP介导hTRAIL基因的体内转染

4.3 CBSA-NP介导TRAIL基因对胶质瘤的靶向性治疗

5 小结

第六部分 载阿克拉霉素的阳离子白蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸纳米粒抑制胶质瘤及脑内递药的初步评价

1 仪器和试剂

1.1 仪器

1.2 材料和试剂

1.3 实验动物

2 实验方法

2.1 载阿克拉霉素CBSA-NP的制备

2.2 载阿克拉霉素CBSA-NP对C6的体外抑制实验

2.3 生物样品预处理和分析方法

2.4 微透析法测定脑肿瘤细胞间液游离药物浓度

3 结果

3.1 载阿克拉霉素CBSA-NP的表征

3.2 载阿克拉霉素CBSA-NP对C6的抑制

3.3 阿克拉霉素体内HPLC分析方法的建立

3.4 微透析实验

4 讨论

4.1 载阿克拉霉素CBSA-NP的制备

4.2 载阿克拉霉素CBSA-NP对C6的抑制

4.3 载阿克拉霉素CBSA-NP治疗胶质瘤的体内研究

5 小结

总结

课题的创新性

参考文献

综述

中英文缩写对照

作者简介

附件

致谢

论文独创性声明

论文使用授权声明

发布时间: 2005-09-19

参考文献

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