棉花纤维发育的蛋白质组学研究

论文摘要

随着棉花分子生物学、功能基因组学的发展，越来越多的棉花纤维发育相关基因得到克隆和测序，尤其是大规模的EST测序计划的实施，公共数据库中的公布的EST序列正快速的增长，大大促进了棉花纤维发育过程中基因的表达谱及其调控机制等相关研究，同时也为未测序生物的蛋白质组学研究奠定了基础。功能基因组学的任务是要构建基因组-基因表达-表现型关系图，从DNA→RNA→蛋白质→代谢→性状这个复杂网络之中，蛋白质分析是最大的障碍。然而，大多数基因又是以蛋白质为最终产物作用于细胞，所以仅仅依赖于RNA水平上的基因表达数据，不能完整地反映基因的功能。蛋白质翻译水平上的调控机制、蛋白质分解、区隔化和翻译后修饰（如糖基化、磷酸化、酰基化、脂化等）等调控机制与细胞功能以及最终性状表现有着更为直接的联系。因此开展棉花蛋白质组学研究对于了解棉花高产、优质、抗逆等重要性状的形成和分子调控机制有着重要的意义。本研究首先比较了16种聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的不同考马斯亮蓝染色方法的染色效果和检测灵敏度，结果表明胶体考马斯亮蓝G250染色方法和修改后考马斯亮蓝R250的Meyer染色方法的灵敏度最高，可以达到20ng／带，银染的灵敏度为10ng／带，曙红不能对胶内蛋白质进行染色，统一了关于不同染色方法的灵敏度或染色效果的混乱描述。胶体考马斯亮蓝G250染色方法灵敏度高，背景低，无需脱色，和质谱分析兼容性好，是常规蛋白质组学研究的首选方法。在胶体考马斯亮蓝G250染色过程中，三氯乙酸的固定时间长短影响胶的背景，水质的高低影响染色灵敏度。使用TCA固定4小时，所有试剂使用超纯水配制可以获得最佳染色效果。银染的灵敏度比胶体考马斯亮蓝G250染色的灵敏度只高出一倍，但是前者的染色强度比后者要强得多，因此，采用胶体考马斯亮蓝G250染色的时候，电泳的上样量要适当提高。蛋白质组学研究中，同一样品或者同样一块胶可以分别或先后使用胶体考马斯亮蓝G250染色和银染方法染色，可以获得更多的信息。蛋白质的提取是直接关系到检测蛋白质种类多少和双向电泳图谱质量的另一个重要技术问题。我们的研究表明：酚抽提法适用于棉花胚珠、纤维、根等组织的或器官蛋白质的提取，而三氯乙酸法不能有效提取棉花胚珠或纤维的蛋白质。酚抽提法提取棉花胚珠和／或纤维蛋白质获得率高、蛋白质种类多、等电点分布范围广、容易溶解获得高浓度溶液。在棉花蛋白质提取初始期，加入高浓度的聚乙烯吡咯烷酮和还原剂巯基乙醇以及适当浓度的还原剂NBDH，可以有效去除酚类物质，避免其对2-DE的干扰，获得更佳的双向电泳图谱。裂解液中加入硫脲能更充分、更全面（种类）溶解蛋白质。杯上样可以稳定获得高解析度，更多的蛋白质点（尤其是高分子量的蛋白质）。在蛋白质鉴定方面，通过比较基质辅助激光解吸飞行质谱（MALDI-TOF）和基质辅助激光解吸飞行串联质谱（MALDI-TOF／TOF）两种分析方法以及基于肽质量指纹（PMF）和碎片指纹（FFP）数据，利用MASCOT、ProFound、MS-Fit和Aldente四种不同引擎搜索不同蛋白质数据库进行生物信息学的鉴定结果，我们认为MALDI-TOF适合于大规模初步鉴定蛋白质。把握好样品处理、对照样品的设置、数据获取等关键环节才能获得可信的鉴定结果。用PMF搜索蛋白质数据库，不同软件的算法、分值、以及可用的数据库不相同，搜索结果可能大相径庭。PMF搜库应以MASCOT和ProFound检索为主，两者相互印证相互补充。MS-Fit和Aldente的结果只能作为参考。MASCOT（或者其它商业软件）PMF检索专一的本地数据库（如棉花的EST）可以得到更好的鉴定结果，它是无基因组序列生物蛋白质鉴定的重要途径。基于串联质谱分析的蛋白质鉴定结果更为可信，也是目前能被同行接受的鉴定方法。串联质谱可以通过离子搜索模式、序列查询模式以及从头序列解析分析（de novo sequencing）等途径来鉴定蛋白质，其结果可以相互验证。棉花纤维是棉花胚珠部分表皮细胞经过分化、扩展、次生壁加厚以及成熟等四个阶段，大约60天发育而成。不同发育阶段既有各自独特的特征，又彼此重叠，不同发育阶段的长短、基因及其蛋白质的表达模式最终决定棉花纤维产量的高低以及长度、强度、细度等重要品质性状的优劣。以陆地棉TM-1开花后6天剥离纤维的裸露胚珠为原始对照，比较了开花后6天（轴向快速伸长期）、开花后10天（扩展高峰期）、开花后14天（初生壁合成转向次生壁合成前期）、开花后18天（初生壁合成转向次生壁合成中期）、开花后22天（初生壁合成转向次生壁合成后期，次生壁开始沉积）纤维细胞蛋白质组的双向电泳图谱的差异，共检测到77个差异表达的蛋白质点。差异蛋白质点经过胶内胰蛋白酶酶切和MALDI-TOF质谱分析，获得的PMF用MASCOT分别检索NCBInr绿色植物蛋白质数据库、棉花EST数据库，仅有26％的蛋白质得到可信的鉴定，这可能与棉花数据库相对贫乏，以及棉花纤维发育过程中蛋白质的翻译后修饰程度很高有关。鉴定的20种蛋白质中有5个蛋白质与未知功能的EST匹配，说明棉花有一些独特的基因参与了棉花纤维的发育。另外15个蛋白质分别是：含有START结构域的转录因子、成熟酶、翻译延长因子、热激蛋白83、细胞壁结构蛋白、过氧化物酶、转座酶、代谢作用的酶，说明纤维伸长发育不同时期涉及基因表达的转录水平的调节（可能与MYB基因有关）、RNA的可变剪切、新蛋白质的合成、蛋白质装配-卸载等结构变化、细胞壁结构蛋白质的合成、活性氧的清除、转座酶引起的DNA水平的基因表达调控以及各种代谢过程的变化。正常的棉花胚珠表皮可以发育成长绒和短绒两种纤维，除了保卫细胞之外，每个表皮细胞都有发育成纤维细胞的潜能。不过自然状态下棉花纤维细胞只占胚珠表皮细胞的三分之一左右，因此，常规的方法很难研究发生在开花前3天至2天的长绒纤维细胞的分化。另外，长绒纤维和短绒纤维在发育时间上前后连接，在空间分布上彼此交错，很难区分，所以不容易分别研究长绒纤维和短绒纤维的分化与发育。我们比较了徐州142正常胚珠和徐州142无絮突变体胚珠开花前3天、开花当天的蛋白质组的双向电泳图谱，以鉴定在长绒纤维分化和启动发育起重要作用的蛋白质，从而揭示纤维分化和启动的分子机制。比较开花前3天、开花当天李氏无纤维突变体自交系分离的纤维正常发育胚珠和无长绒纤维（实际上是纤维有限伸长）突变体胚珠，以及开花后4和8天纤维蛋白质组的双向电泳图谱的差异，以发现和鉴定在纤维早期伸长中起关键作用的因子。共检测到74个有表达差异的蛋白质点，将差异表达的蛋白质点进行胶内胰蛋白酶酶切和MALDI-TOF／TOF串联质谱分析，和生物信息学鉴定，鉴定了其中48个蛋白质，其中有12个蛋白质只能在棉花EST中鉴定。根据蛋白质的功能可以把他们划分为调控蛋白，转录因子，蛋白质合成，蛋白质折叠、装配、降解，防卫反应，能量代谢，细胞骨架，逆转录转座子，代谢酶，以及未知功能的蛋白质。我们的研究没有在蛋白质水平上证实根据转录组学研究中鉴定的象MYB基因对于纤维分化、expansin对于纤维的起始发育等起关键作用的基因的作用。除了我们只鉴定了全部差异表达的中的48个，还有36没有鉴定这个原因之外，可能还与现有蛋白质组学技术的某些限制，例如某些蛋白质不容易分离，某些调控作用的蛋白质的表达水平往往很低，现有的技术不容易检测到等因素有关。然而，我的研究提供了很多非常重要的新的信息，例如RNA加工、蛋白质合成、加工、异构化、折叠、降解、定位等过程的变化，从而引起信号转导、激素运输和响应、酶活性、细胞骨架的构象改变以及物质和能量代谢的改变等，进而影响纤维发育。为进一步研究纤维发育的分子机理提供了新的思路。鉴定的48种蛋白质中有7个定位于线粒体中，其中有2个是三羧酸循环中的两个限速反应酶，1个是呼吸链上的电子传递体，1个参与蛋白质加工的肽酶，暗示线粒体功能的紊乱可能是这两个突变体纤维异常发育的重要原因。在代谢酶中有6个酶与糖代谢有关，它们分别是磷酸戊糖途径、糖酵解和三羧酸循环以及多糖合成的一些关键酶。可见糖代谢网络的调整可能是纤维不能正常发育的直接原因。另外我们还讨论各种蛋白质及其在纤维发育中的功能和作用。

论文目录

中文摘要

英文摘要

缩略词符号单位

第一部分文献综述

第一章棉花纤维发育研究进展

一、细胞壁与棉花纤维

（一）细胞壁的化学

1. 单糖

2. 细胞壁的大分子

（二）细胞壁的构架

（三）细胞壁的生物合成和装配

（四）细胞壁与生长

（五）细胞壁可以成为食物、饲料和纤维

二、棉花纤维发育的研究进展

（一）结构植物学研究

1. 纤维细胞的分化

2. 纤维细胞的起始发育

3. 纤维伸长

4. 次生壁的合成

5. 纤维的成熟

（二）分子生物学研究

1. 纤维原始细胞分化和突起

2. 纤维伸长

3. 从初生壁合成向次生壁合成的转变

4. 棉花纤维次生壁形成的分子机制

5. 棉花纤维成熟的分子机制

（三）基因组学研究

1. 棉花遗传图谱研究进展

2. 棉花纤维发育的功能基因组学研究

（四）蛋白质组学研究

第二章蛋白质组学

一、从功能基因组学到蛋白质组学

（一）功能基因组学的研究内容

1. DNA水平

2. RNA水平

3. 蛋白质水平

4. 系统生物学

（二）功能基因组学的研究方法

1. 表达序列标签与基因组测序分析

2. 功能基因表达谱

3. 反求遗传学研究

4. 蛋白组研究

二、蛋白质组学研究的内容与意义

（一）蛋白质组学的概念

（二）进行蛋白质组学研究必要性和意义

（三）蛋白质组学研究的内容

三、蛋白质组学研究技术

（一）蛋白质的分离

1. 样品制备和溶解

2. IEF

3. IPG胶条的平衡

4. 第二向电泳: SDS-PAGE

5. 蛋白质的检测和定量

6. 2-D图像的计算机分析和数据库建立

7. 自动化程序

（二）蛋白质的质谱鉴定

（三）生物信息学

四、植物蛋白质组学研究进展

（一）植物蛋白质的表达谱研究

（二）翻译后修饰

（三）蛋白质-蛋白质相互作用

（四）蛋白质生物信息学

本研究的目的与意义

第二部分研究报告

第三章适用于蛋白质组学研究的聚丙烯酰胺胶中蛋白质染色方法的研究

1 材料与方法

1.1 电泳样品准备

1.2 电泳

2 结果与分析

2.1 16种染色-脱色方法的效果评价

2.2 胶体CBB G-250染色方法及其配方分析

2.3 影响胶体CBBG-250染色效果的其它实验因素

2.4 与银染效果的比较

3 讨论

4 结论

第四章棉花纤维和胚珠蛋白质提取方法以及电泳技术的研究

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 试验方法

2 结果和分析

2.1 两种方法提取的蛋白质重量的比较

2.2 两种方法提取的蛋白质的2D胶图谱的比较

2.3 从样品中去除酚类干扰物质

2.4 蛋白质裂解液对棉花蛋白质2-DE的影响

2.5 IEF不同上样方法对棉花蛋白质2-DE的影响

3 讨论

4 结论

第五章蛋白质组学研究中的生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.3 数据分析与生物信息学鉴定

2 结果和分析

2.1 不同发育阶段的棉花纤维蛋白质2-DE胶图谱比较

2.2 蛋白质胶内酶切后的质谱分析

2.3 用 PMF搜索蛋白质数据库

2.4 用MS/MS数据进行蛋白质数据库搜索

2.5 EST数据库的应用

3 讨论

3.1 几种 PMF搜索程序的评价

3.2 基于 PMF数据的蛋白质鉴定

3.3 串联质谱的应用

4 结论

第六章陆地棉TM-1伸长发育阶段纤维的蛋白质组学研究

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 试验方法

2 结果和分析

2.1 不同发育阶段的棉花纤维蛋白质2-DE胶图谱比较

2.2 差异表达蛋白质的鉴定

3 讨论

4 结论

第七章棉花纤维分化和伸长发育机制的蛋白质组学研究

1 材料与方法

1.1 植物材料与取样

1.2 试验方法

2 结果和分析

2.1 无絮棉和李氏无纤维突变体的形状观察

2.2 棉花纤维细胞分化和起始发育相关蛋白质的分离

2.3 与棉花纤维起始和伸长发育相关蛋白质的分离

2.4 棉花纤维分化和膨胀发育相关蛋白质的鉴定

3 讨论

3.1 调控蛋白质

3.2 蛋白质合成、折叠、组装和分解有关蛋白质

3.3 防卫反应蛋白质

3.4 与糖代谢有关的酶

3.5 其它蛋白质

4 结论

全文结论

参考文献

致谢

发表论文

棉花纤维发育的蛋白质组学研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢