犬血清弓形虫IgG抗体快速诊断金标试纸条的研制

论文摘要

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的以孕妇（畜）流产、弱胎、畸胎、死胎和儿童（幼畜）生长受阻、死亡等为特征的一种人畜共患病。该病广泛存在于世界各地,弓形虫宿主范围广泛,人和犬为其中间宿主,都存在一定的感染率,据报道人的弓形虫感染与养犬存在一定关系。目前,国内外学者已建立多种检测弓形虫抗原或抗体的方法,如病原学检测、间接血凝检测、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、PCR检测等,但这些方法操作较复杂、费时长且需要一定的仪器设备,在临床推广应用中受到一定的限制。因此,建立一种简易、快速、特异性强的检测方法,专用于犬弓形虫病的血清学诊断与流行病学调查,不仅有助于了解犬感染情况,同时对于阻断弓形虫由犬向人的传播也有重要的意义。本研究用弓形虫速殖子腹腔感染昆明小鼠分别制备了弓形虫可溶性抗原和代谢分泌抗原,并用制备的代谢分泌抗原免疫健康犬获得了犬弓形虫阳性血清;采集健康犬的血清,用硫酸铵盐析法和葡聚糖G-200柱层析法纯化制得犬IgG,以其常规免疫健康家兔,当双向琼脂扩散试验检测效价达到1∶64以后收集兔血清,并经辛酸-硫酸铵盐析提纯制得兔抗犬IgG;用柠檬酸三钠还原法烧制直径为20nm的胶体金颗粒,以胶体金颗粒标记兔抗犬IgG制作成金标垫,标记的最适PH值为9.0,1ml胶体金的最适标记量为12μg,将弓形虫可溶性抗原和羊抗兔IgG分别包被于硝酸纤维素膜上做为检测线与质控线制成免疫层析试纸条。当犬血清中的弓形虫IgG抗体与试纸条上的金标抗体（兔抗犬IgG）结合后沿着硝酸纤维素膜移动,在膜上的检测线与质控线处发生特异性抗原抗体反应形成肉眼可见的红色线条。实验表明胶体金试纸条最佳检测条件:弓形虫抗原的点膜浓度为2.5mg/ml,羊抗兔IgG点膜浓度为0.75mg/ml,胶体金标记兔抗犬IgG作1∶2稀释时的检测带清晰且背景较浅。用所研制的试纸条与兰州兽研所生产的弓形虫间接血凝试剂盒比较,同时检测从临床病例中按随机抽样法采集的94份宠物犬血清,及6份感染犬血清。94份宠物犬血清中,试纸条法检出3份,间接血凝试剂盒检出4份;6份感染犬血清中,试纸条法检出4份,间接血凝试剂盒也检出4份,且这4份血清为相同血清,这表明两者对感染犬血清检测符合率为100%。总检测结果表明:两法总符合率为99.0%（99/100）,其中阳性和阴性符合率分别为87.5%（7/8）和98.9%（92/93）。结论:本实验研制出的胶体金免疫层析试纸条和IHA试剂盒符合性好,检测犬血清中的弓形虫IgG抗体重复性好、操作简便、快速,只需10～15min,不需特殊仪器设备、结果客观准确,肉眼可判断,表明该法具有较好的犬血清弓形虫抗体诊断价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 弓形虫的发现历史及其病原学
• 1.1.2 弓形虫病的危害
• 1.1.3 弓形虫病的预防与治疗
• 1.1.4 弓形虫病的诊断技术研究进展
• 1.1.5 胶体金技术研究进展
• 1.2 研究的内容和目标
• 1.3 研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要化学试剂
• 2.1.3 实验动物与虫株
• 2.1.4 试纸条主要材料
• 2.1.5 主要溶液及配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 弓形虫抗原的制备
• 2.2.2 犬抗弓形虫抗体的制备
• 2.2.3 兔抗犬IgG的制备与纯化
• 2.2.4 胶体金的制备
• 2.2.5 胶体金标记抗体的制备
• 2.2.6 试纸条最佳检测条件的确定及组装
• 2.2.7 试纸条使用方法及结果评判标准
• 2.2.8 试纸条各项性能的测定
• 2.2.9 试纸条与弓形虫间接血凝试剂盒对临床样本的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 弓形虫抗原的制备
• 3.1.1 弓形虫速殖子收集、纯化与鉴定
• 3.1.2 弓形虫可溶性抗原的浓度测定
• 3.1.3 弓形虫代谢分泌抗原的制备
• 3.2 犬抗弓形虫抗体的制备
• 3.3 兔抗犬IgG的制备与纯化
• 3.3.1 纯化后犬IgG的鉴定
• 3.3.2 兔的免疫与效价测定
• 3.3.3 兔抗犬IgG的纯化及鉴定
• 3.4 胶体金的制备
• 3.5 胶体金标记抗体的制备
• 3.5.1 最佳标记pH值确定
• 3.5.2 目测法确定最适蛋白标记量
• 3.6 试纸条最佳检测条件的确定
• 3.6.1 硝酸纤维膜的选择
• 3.6.2 试纸条检测线-T线条件的确定
• 3.6.3 试纸条质控线-C线条件的确定
• 3.6.4 硝酸纤维膜最适封闭条件的确定
• 3.6.5 免疫胶体金复合物稀释度的确定
• 3.7 试纸条各项性能的测定
• 3.7.1 特异性试验
• 3.7.2 敏感性试验
• 3.7.3 重复性试验
• 3.7.4 稳定性试验
• 3.7.5 检测结果保存时间的观察
• 3.8 试纸条与弓形虫间接血凝试剂盒对临床样本的检测
• 4 讨论
• 4.1 弓形虫抗原的制备与纯化
• 4.2 弓形虫代谢分泌抗原及犬抗弓形虫抗体的制备
• 4.3 兔抗犬IgG的制备与纯化
• 4.4 胶体金的制备
• 4.5 胶体金标记抗体
• 4.6 试纸条材料的选择与组装
• 4.7 对临床样本的检测
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录