论文摘要
目的本研究探讨藏红花素（crocin）对人急性白血病细胞HL-60增殖抑制的影响及其促凋亡机制。方法无菌条件下配制crocin溶液,实验分为A-F六组,crocin终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5.0和10mg/ml。采用血细胞计数板人工计数法测定HL-60细胞在不同浓度crocin作用后的生长曲线,利用荧光显微镜观察细胞形态学变化,用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合染液染色,在荧光显微镜下计数凋亡细胞,计算凋亡率。MTT法检测细胞的增殖情况,计算不同浓度crocin作用于HL-60细胞不同时间的抑制率。流式细胞仪检测crocin作用48h后HL-60细胞周期分布,RT-PCR检测crocin作用24、48h后bcl-2,bax基因的表达。结果①细胞生长曲线的测定结果显示,当Crocin浓度为0.625-10mg/ml,体外可抑制HL-60细胞的增殖,随着药物浓度的升高,作用时间的延长,HL-60细胞数目逐渐减少,呈现出抑制作用,以10mg/ml浓度作用48h时抑制作用最明显。MTT法结果显示,crocin作用24h时,随着药物浓度的升高,抑制率逐渐升高,组间比较差异有显著性（F=2.84,P<0.05）,以10mg/ml浓度时抑制率最高。crocin作用48h时,随着药物浓度的升高,实验各组细胞抑制率逐渐升高,组间比较差异有显著性（F=4.71,P<0.05）。当crocin浓度为10mg/ml时,作用48h与24h时相比,差异有显著性（t=3.59,P<0.05）。②荧光显微镜下对细胞观察结果显示,crocin作用24h后,对照组中偶见凋亡细胞,在0.625-5mg/ml时,随着药物浓度的增加,凋亡细胞数目明显增多,以5mg/ml浓度凋亡细胞形态最为明显。10mg/ml浓度组,凋亡细胞少见,可见大量坏死及崩解的细胞。作用48h时,以5mg/ml浓度组凋亡细胞数目明显增多,且随着作用时间延长,晚期凋亡细胞增多。在0.625-5mg/ml范围内,HL-60细胞凋亡率逐渐升高,浓度为10mg/ml时凋亡率反而下降,药物浓度过高表现出坏死作用。③流式细胞仪检测细胞周期结果显示,crocin作用于HL-60细胞48h后,在0-5mg/ml浓度范围内,GO/G1期细胞数比例组间比例差异有显著（F=185,P<0.05）,组内两两比较差异仍有显著性（P<0.05）。在0.625-5mg/ml药物范围内,随着药物浓度的升高,GO/G1期细胞数比例逐渐升高,以浓度为5mg/ml时GO/G1期细胞数比例最高,与实验各组比较差异有显著性（P均<0.01）。浓度为10mg/ml时,GO/G1期细胞数比例反而下降,与浓度为5mg/ml时比较差异有显著性（P<0.05）,与A-D各组比较差异无统计学意义（P均>0.05）④RT-PCR检测结果显示,作用时间分别为24h、48h时,随crocin作用浓度的升高,bcl-2基因条带亮度逐渐减弱。灰度扫描比值结果显示：在0-10mg/ml药物范围内,组间比较差异有显著性（P<0.05）,组内两两比较,A组与B组比较无统计学意义（P>0.05）。随药物浓度升高,bcl-2基因表达逐渐减少,以10mg/ml表达最弱。作用时间分别为24h、48h时,随crocin作用浓度的升高,bax基因条带亮度逐渐增强。灰度扫描比值结果显示：在0-10mg/ml药物范围内,组间比较差异有显著性（P<0.05）,组内两两比较,A组与B组比较无统计学意义（P>0.05）。随药物浓度升高,bax基因表达逐渐增强,以10mg/ml表达最强。结论1、通过不同浓度crocin作用,HL-60细胞生长明显受抑制,并呈现出剂量时间依赖关系。在0.625-5mg/ml范围内,HL-60细胞凋亡率逐渐升高。当crocin浓度10mg/ml时,HL-60细胞凋亡率并没有升高,反而下降,表现为细胞坏死。2、Crocin对HL-60细胞周期起阻滞作用,被阻滞于G0/G1,且在5mg/ml时阻滞作用最明显。浓度为10mg/ml时,G0/Gl期细胞数比例反而下降,药物浓度过高时,对HL-60细胞主要表现为细胞毒性作用。3. Crocin抑制Bcl-2基因表达,在1.25-10mg/ml范围内均表现出抑制作用,在浓度为10mg/ml作用48h时抑制作用最强。Crocin促进Bax基因的表达,在1.25-10mg/ml范围内均表现出促进作用,在浓度为10mg/ml作用48h时促进作用最强。4、Crocin可促进细胞凋亡,抑制细胞的增长,其机制为抑制了Bcl-2基因表达,促进了Bax基因表达,最终导致了细胞增殖周期被阻滞于G0/G1期。
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