沙丁胺醇酶联免疫分析及胶体金免疫层析方法的研究

论文摘要

本论文对食用猪肉中禁用药物沙丁胺醇的酶联免疫分析方法以及胶体金免疫层析检测方法进行了系统研究和分析。制备出沙丁胺醇丁二酸作为半抗原,混合酸酐法制备出免疫原SAL-KLH和SAL-HRP,碳二亚胺法制备包被原SAL-OVA,免疫后得到高效价和高灵敏度的沙丁胺醇多克隆抗体。通过优化各项实验条件,建立了简便、快捷、实用的沙丁胺醇直接竞争酶联免疫（ELISA）分析方法,此法灵敏度IC50=0.80±0.10μg/L；检出限IC15=0.06±0.02μg/L。对所建立方法的性能指标进行了系统评价,考察了方法检出限、精密度、准确度,批间和批内变异系数均小于20%。以猪肉为例,确定了肉类食品的基质的处理方法,用稀释的方法消除基质可有效消除基质影响,实际样品的检出限为0.60μg/kg。测定了7.0μg/kg、24.0μg/kg、50.0μg/kg三个添加浓度的检测,回收率在85%～100%之间。同时建立了沙丁胺醇胶体金免疫层析方法,进过优化得到方法的检出限为1.00μg/L,同样选取猪肉作为检测样品,经0.22μm微孔滤膜过滤后直接上样检测,在实际样品中的检出限为10.00μg/L。分别向猪肉样品中添加三个浓度的沙丁胺醇,即7μg/kg、50μg/kg、100μg/kg;同时采用两种方法进行检测沙丁胺醇标准品,经胶体金免疫层析法与直接竞争酶联免疫分析方法同时检测,结果一致性较好,验证了方法的准确性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 兽药残留现状
• 1.1.2 兽药残留的危害
• 1.1.3 兽药残留的应对策略以及发展趋势
• 1.2 食品中常见的β-肾上腺素受体激动剂残留
• 1.3 沙丁胺醇概述
• 1.3.1 沙丁胺醇的理化性质
• 1.3.2 沙丁胺醇的毒性
• 1.3.3 沙丁胺醇的残留限量标准
• 1.4 常用检测兽药残留的方法概述
• 1.4.1 微生物学法
• 1.4.2 生物传感器法
• 1.4.3 仪器分析法
• 1.4.4 免疫分析法（IAs）
• 1.5 酶联免疫吸附测定法（ELISA）
• 1.5.1 酶联免疫分析方法的主要类型
• 1.5.2 酶联免疫分析方法研究现状及展望
• 1.6 胶体金免疫层析技术及其应用
• 1.6.1 胶体金的性质和特点
• 1.6.2 胶体金免疫层析试纸条的结构
• 1.6.3 免疫胶体金层析技术的现状和发展趋势
• 1.7 论文研究的目的及意义
• 1.8 论文研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品与试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用溶液的配制
• 2.1.4 实验样品
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 硫酸沙丁胺醇的人工半抗原的制备
• 2.2.2 人工免疫原、包被原和酶标抗原的制备
• 2.2.3 沙丁胺醇抗体的制备及其浓度测定
• 2.2.4 直接竞争酶联免疫检测方法的建立
• 2.2.5 胶体金免疫吸附测定法的初步建立
• 2.2.6 酶联免疫检测法验证胶体金免疫层析方法的有效性
• 3 结果与讨论
• 3.1 沙丁胺醇人工抗原的合成
• 3.1.1 合成中间产物沙丁胺醇游离碱的表征
• 3.1.2 合成的半抗原沙丁胺醇丁二酸酐衍生物的表征
• 3.2 沙丁胺醇抗体的制备
• 3.2.1 抗血清效价和特异性的测定
• 3.2.2 抗体的纯化及抗体浓度的测定
• 3.3 直接竞争酶联免疫检测方法的建立
• 3.3.1 酶标抗原浓度和抗体包被浓度的确定
• 3.3.2 封闭液浓度的确定
• 3.3.3 沙丁胺醇直接竞争ELISA标准曲线的绘制
• 3.3.5 沙丁胺醇抗体特异性的测定
• 3.3.6 样品消除基质影响
• 3.3.7 方法的准确度验证
• 3.3.8 ELISA方法的精密度
• 3.3.9 方法的灵敏度和检出限
• 3.4 胶体金免疫层析检测方法的初步建立
• 3.4.1 胶体金的制备
• 3.4.2 制备金标抗体
• 3.4.3 胶体金试纸条的组成及检测步骤
• 3.4.4 层析条件的选择
• 3.4.5 最低检出限的确定
• 3.4.6 沙丁胺醇免疫层析检测法特异性的测定
• 3.4.7 实际样品分析
• 3.5 酶联免疫检测法验证胶体金免疫层析法的有效性
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢