降解纤维素菌种筛选及纤维素降解研究

论文摘要

利用纤维素的最佳方法是微生物降解转化,鉴于目前纤维素降解菌株酶活力低、纤维素酶诱导产酶及纤维素降解机理不完全清楚等限制纤维素资源有效利用的情况下,为了有效利用纤维素这种可再生能源,筛选高效降解菌,研究菌株产酶机制以及纤维素降解机理仍然具有重要的理论和实践意义。本文从57份土样中,通过分离纯化得到97株菌株。对其进行刚果红鉴别培养基和滤纸条液体培养法初筛,并结合复筛得到2株纤维素酶活较高的菌株。经形态学鉴定H-11为简青霉（Penicillium simplicissimum）,C-08为绿色木霉（Trichoderma viride）。研究了几种影响二菌株发酵产酶的因素,液体发酵结果表明:麸皮和稻草为适合碳源,两者比例H-11为4:3,C-08为5:2;最适有机氮源为豆饼粉,而无机氮源分别是KNO3和（NH4）2SO4。H-11产酶最适为豆饼粉,而C-08产酶的（NH4）2SO4:豆饼粉比例为1:5。最适产酶碳源和氮源比例,H-11为7:1,C-08为5:1;最适百分含量,都为3.6%;最适产酶pH,H-11为3.6,C-08为3.2;最适温度都为30℃;最适产酶时间H-11为144h,C-08为96h。固态发酵结果表明:秸秆粉和麸皮为2∶4最适合产酶;尿素和氨态氮适合H-11产酶。氨态氮适合C-08产CMCase,NO3-利于产Xylanase,其中NH4NO3最好;料水比1∶1比较适合H-11产CMCase,1∶1.5适合产Xylanase。料水比1∶2适合C-08产CMCase,1∶2.5适合产Xylanase;H-11随底物粒度的降低CMCase增加,在60100目时产Xylanase最低。稻草粉粒度40100目时,适合C-08产CMCase,此范围外适合产Xylanase;初始pH为3和4时则适合H-11菌株产CMCase和Xylanase。pH值为4适合C-08产酶;孢子接种量为78×107孢子/mL时适合两株菌产酶;28℃适合H-11产酶,在低于28℃时适合C-08产酶;发酵时间H-11为60h,C-08为72h。固定化研究表明,制备小球的最适海藻酸钠溶液浓度为5%。麸皮汁较适合菌株产酶,H-11比C-08产酶能力强。菌株间亲和性不强。H-11则在pH为3和4时,更适合产CMCase和Xylanase,C-08产酶适宜pH为7。固定化细胞产酶能力强于游离细胞。Tween-80有利于提高菌株的产酶活力。利用液体培养和洗涤菌丝诱导培养法研究了碳源对菌株的诱导特性。结果发现D-甘露糖对H-11有较好的诱导作用,葡萄糖对C-08有较好的产酶作用。葡萄糖促使H-11、C-08产生FPase、CMCase、C1和β-Gase,各种酶产量在菌株间及菌株内差别很大。制备细胞外、细胞壁膜、细胞内纤维素酶,并用其分别转化纤维二糖,对转化产物高效液相色谱定性分析,从而探讨碳源的诱导本质。结果显示:H-11胞内酶和C-08的胞外酶的转化产物,除产生葡萄糖外,亦产生一种未知的物质A。胞壁膜酶无转化作用。H-11的胞外酶和C-08的胞内酶液对纤维二糖除水解外亦有转化作用。从而证明纤维二糖不是菌株的诱导物。将H-11液体发酵粗酶液经硫酸铵分级沉淀、柱层析后得到电泳纯的β-GaseⅠ、β-GaseⅡ和CMCase组分。对纯组分的理化性质研究表明:三组分的分子量分别为126.0KDa、77.8KDa和33.2kDa;最适温度都为60℃,分别在40℃、40℃和50℃以下稳定;最适pH值为pH4.45.2、3.64.0和2.8,在pH值4.46.8、2.86.8和2.86.8范围内稳定。Mn2+、Ca2+、Sn2+和Li+对β-GaseⅠ有促进作用,Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Fe3+对β-GaseⅠ有抑制作用;Mn2+、Sn2+和Fe2+对β-GaseⅡ有促进作用,Zn2+、Cu2+、Co2+和Fe3+对β-GaseⅡ有抑制作用;Sn2+对CMCase酶活力有明显的增强作用,Mn2+和Cu2+对酶有显著的抑制作用。β-GaseⅠ水解水杨素的Km和Vmax值分别622.306mg·mL-1和15.480mg·mL-1·min-1,β-GaseⅡ水解水杨素的Km和Vmax值分别26.689mg·mL-1和0.508mg·mL-1·min-1,CMCase作用于CMC-Na的动力学参数Km和Vmax值分别1.744mg·mL-1和14.124mg·mL-1·min-1。三种酶的底物特异性较差,β-GaseⅠ、β-GaseⅡ不以CMC-Na为底物,CMCase不作用于水杨素,除此之外,三组分对MCC、滤纸、几丁质、pNPC和pNPG都有作用。通过对三组分的红外图谱特征频率区进行分析,结果表明其蛋白质二级结构都主要以α-螺旋形式存在。H-11的粗酶液中C1、CMCase对MCC都具有吸附-解吸附作用,而β-Gase对MCC不具有吸附-解吸附作用,三种纯组分和C-08粗酶液中的C1、CMCase、β-Gase对MCC都具有吸附-解吸附作用。β-GaseⅠ和β-GaseⅡ对CMCase降解纤维素有很强的协同降解作用,三种纯组分对C-08粗酶液降解纤维素没有协同作用。H-11的固态、液态发酵和C-08的固态发酵都存在氧化降解机制。

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摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 课题研究的目的和意义

1.2 国内外文献综述

1.2.1 纤维素的研究进展

1.2.2 纤维素酶的产生菌及其生产概况

1.2.3 纤维素酶的分子生物学研究动态

1.2.4 纤维素降解机理研究概况

1.2.5 纤维素酶的应用

1.3 纤维素降解研究中存在的问题

1.4 课题的来源及主要研究内容

1.4.1 课题的来源

1.4.2 主要研究内容

第2章实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 土壤样品

2.1.2 培养基

2.1.3 实验药品

2.1.4 缓冲液和常用试剂的配制

2.1.5 主要仪器

2.1.6 数据统计

2.2 实验方法

2.2.1 纤维素降解菌株的分离纯化

2.2.2 纤维素分解菌液态发酵条件优化

2.2.3 纤维素分解菌固态发酵研究

2.2.4 菌株固定化及固定化产酶过程

2.2.5 碳源对菌株产纤维素酶的诱导作用

2.2.6 菌株纤维素酶的分离纯化

2.2.7 纤维素降解机理研究

第3章纤维素降解菌的筛选和鉴定

3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

3.2 降解纤维素菌株的分离和纯化

3.3 刚果红平板和滤纸条液体培养基筛选

3.4 摇瓶筛选

3.5 菌株的形态学鉴定

3.5.1 H-11 的形态学鉴定

3.5.2 C-08 的形态学鉴定

3.6 关于纤维素降解菌的筛选效果分析

3.7 本章小结

第4章简青霉和绿色木霉产酶及酶解动力学

4.1 简青霉和绿色木霉液态发酵产纤维素酶

4.1.1 培养基成分对两株真菌产纤维素酶的影响

4.1.2 培养条件对两株真菌产纤维素酶的影响

4.2 简青霉和绿色木霉固态发酵产酶研究

4.2.1 两株真菌核酸含量与菌体量线性关系

4.2.2 培养基成分对两株真菌产酶影响

4.2.3 培养条件对两株真菌产酶影响

4.3 简青霉和绿色木霉固定化产酶研究

4.3.1 固定化小球稳定性的研究

4.3.2 简青霉和绿色木霉固定化产酶条件

4.4 简青霉和绿色木霉纤维素酶诱导及粗酶液性质

4.4.1 简青霉和绿色木霉纤维素酶的诱导

4.4.2 简青霉和绿色木霉粗酶液酶学性质

4.5 简青霉和绿色木霉粗酶液降解动力学研究

4.5.1 温度对酶促反应速度的影响

4.5.2 pH值对酶促反应速度的影响

4.5.3 反应时间对酶促反应速度的影响

4.5.4 酶浓度对酶促反应速度的影响

4.5.5 底物浓度对酶促反应速度的影响

4.6 简青霉和绿色木霉产酶及降解特性分析

4.6.1 两株真菌产酶特性的分析

4.6.2 两株真菌诱导产酶及降解特性的分析

4.7 本章小结

第5章简青霉纤维素酶的分离纯化

5.1 几种标准曲线的绘制

5.1.1 蛋白质的标准曲线获得

5.1.2 DNS法绘制木糖标准曲线

5.1.3 对硝基苯酚标准曲线的绘制

5.2 纤维素酶纯化介质选择及酶分子量确定

5.2.1 分离纯化介质对纤维素酶分离效果影响

5.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳确定酶的分子量

5.3 β-GaseⅠ的分离纯化及性质研究

5.3.1 β-GaseⅠ的纯化及分子量测定

5.3.2 β-GaseⅠ的高效液相色谱检测

5.3.3 β-GaseⅠ酶学特性研究

5.3.4 β-GaseⅠ的紫外及红外光谱测定

5.4 β-GaseⅡ的分离纯化及性质研究

5.4.1 β-GaseⅡ的纯化及分子量测定

5.4.2 β-GaseⅡ的高效液相色谱检测

5.4.3 β-GaseⅡ的酶学特性研究

5.4.4 β-GaseⅡ的紫外和红外光谱测定

5.5 CMCase的分离纯化及性质研究

5.5.1 CMCase的纯化及分子量测定

5.5.2 CMCase的高效液相色谱检测

5.5.3 CMCase的酶学特性研究

5.5.4 CMCase的紫外和红外光谱测定

5.6 纤维素酶的分离纯化及特性分析

5.6.1 纤维素酶分离纯化

5.6.2 纤维素酶的酶学特性

5.7 本章小结

第6章简青霉和绿色木霉降解纤维素机理研究

6.1 简青霉和绿色木霉纤维素酶的吸附特性

6.1.1 单组分纤维素酶的吸附特性研究

6.1.2 粗酶液中纤维素酶的吸附特性研究

6.2 简青霉和绿色木霉纤维素酶的诱导

6.3 纤维素酶的协同降解纤维素的研究

6.4 简青霉和绿色木霉纤维素的氧化降解研究

6.5 简青霉和绿色木霉降解纤维素机理的分析

6.5.1 纤维素酶的吸附

6.5.2 纤维素酶的诱导

6.5.3 纤维素的降解机理

6.6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

个人简历

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