无载体无标记玉米转化系统的建立及耐盐品系的选育

论文摘要

转基因植物由于可能带来食品及环境安全性问题，目前已受到广泛关注。本研究从转基因植物引发安全性问题的根源入手，建立了一种无载体、无标记基因的转化体系，通过花粉管通道法将最小线性片段外源基因导入到玉米中，基本上解决了转基因植物的安全性问题。为了实现无载体、无标记基因的转化，本论文采用花粉管通道法将来源于盐生植物辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis Kitag）的BADH基因，以最小线性目的DNA片段为原则设计了由功能基因、表达调控序列（35S启动子，NOS终止子）和T-DNA边界序列3部分组成的转化元件导入玉米，探讨了建立一种无载体、无标记基因的玉米转基因技术体系的可行性。对2076个转化样品的PCR检测结果表明，有27个样品呈阳性，T1代转化材料PCR检测阳性率为1.3％。选取部分PCR阳性样品进行Southern杂交和RT-PCR检测，结果表明，3株T1代转化材料（沈137-19、沈137-20、沈137-21）的基因组整合了外源的BADH基因，并得到了表达。采用稀释1倍的人工海水（NaCl含量约1.25％），对转BADH基因的玉米株系的后代进行苗期盐胁迫筛选，结果表明，经过2周的盐胁迫筛选，沈137-19株系的成活率为62.5％，且植株整齐度相对较好；而未转化玉米则表现为逐渐萎蔫、失绿，仅有8.0％的未转化玉米能够存活，故选择沈137-19株系进行下一步的分析。选取盐胁迫2周后成活的转基因玉米进行PCR检测，结果表明外源BADH基因能够在后代玉米材料中得到遗传。选取部分PCR阳性的转基因玉米后代材料进一步进行了系统的生理检测，结果表明：在盐胁迫条件下，转基因植株甜菜碱的含量为15.7～19.5μg g-1，是未转化玉米的15～19倍；转基因玉米的相对含水量明显比未转化玉米高8％～28％；转基因玉米SOD／POD酶活性也显著高于未转化玉米，其SOD活性为未转化玉米的1.2～1.5倍，POD活性为未转化玉米的1.4～1.9倍；转基因玉米后代材料的相对电导率仅为对照材料的69％～71％；转基因玉米MDA含量也明显低于对照，说明转基因植株的细胞膜在盐胁迫条件下受到了较好的保护；转基因玉米的叶绿素含量为对照材料的1.12～1.16倍，盐胁迫下转基因玉米的净光合速率为22.2～29.5μmolCO2m-2s-1，而对照仅为18.1μmolCO2m-2s-1，转基因植株的蒸腾速率亦小于对照材料，且呈显著性差异，说明在盐胁迫条件下转基因玉米的光合系统相对于未转化玉米更稳定。田间盐胁迫试验及生理检测结果进一步证明了BADH基因在转基因玉米后代得到了表达，同时也为培育转BADH基因玉米纯系奠定了重要的基础。植物耐盐的另一机制是利用液泡膜上存在的转运蛋白将细胞内的离子区域化。利用已建立的玉米转基因技术体系，将Na+／H+转运蛋白基因AlNHX1通过花粉管通道法导入玉米中，PCR及Southern杂交结果证明了AlNHX1基因已整合到玉米基因组中，进一步证明了本研究所建立的无载体、无标记基因的玉米转化体系的可行性。为了进一步提高玉米转化率，本研究在花粉管通道法的基础上，提出了一种新的植物转化方法——子房滴注法，并对其进行了初步的研究。本研究通过花粉管通道法将无载体、无标记基因的最小线性片段BADH基因导入玉米，获得的两个转BADH基因的株系已经通过了中华人民共和国农业转基因生物安全管理办公室的安全评价，生物安全等级为Ⅰ级，现已进入中间试验。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 植物转化方法的分析及生物安全性的探讨
• 1.1.1 植物转化方法的分析
• 1.1.2 转基因植物的生物安全性
• 1.2 中国土地的盐碱化现状
• 1.2.1 中国盐碱土的分布和形成原因
• 1.2.2 中国盐碱土的分类
• 1.3 盐胁迫对植物造成的伤害
• 1.4 植物耐盐性的提高
• 1.4.1 植物对盐胁迫适应的表现
• 1.4.2 植物的耐盐机理
• 1.5 甜菜碱的生理作用及相关的合成酶
• 1.5.1 甜菜碱的生理作用
• 1.5.2 甜菜碱的生物合成及相关合成酶
• 1.6 植物耐盐基因工程研究进展
• 1.6.1 耐盐相关基因的研究
• 1.6.2 植物耐盐基因工程策略探讨
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 最小线性甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因转化元件转化玉米的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 外源功能基因
• 2.1.5 基因转化元件的制备
• 2.1.6 玉米花粉管通道转化方法
• 1代转化材料的检测'>2.1.7 T₁代转化材料的检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PCR检测
• 2.2.2 PCR产物测序
• 2.2.3 点杂交（Dotblot）检测
• 2.2.4 Southernblot检测
• 2.2.5 RT-PCR检测
• 2.3 讨论:
• 2.4 小结:
• 3 转BADH基因玉米后代分子检测及耐盐生理鉴定
• 3.1 材料与方法:
• 3.1.1 植物材料:
• 3.1.2 试剂:
• 3.1.3 实验仪器:
• 3.1.4 盐胁迫条件下玉米成活率的统计:
• 3.1.5 转BADH基因后代材料PCR检测:
• 3.1.6 甜菜碱含量的测定:
• 3.1.7 转BADH基因玉米后代生理生化指标的测定:
• 3.2 结果与分析:
• 3.2.1 玉米转BADH基因株系后代的成活率分析
• 3.2.2 玉米转BADH基因株系后代的PCR检测
• 3.2.3 甜菜碱含量
• 3.2.4 叶片相对电导率
• 3.2.5 叶绿素含量
• 3.2.6 叶片的相对含水量
• 3.2.7 丙二醛含量
• 3.2.8 SOD/POD活性
• 3.2.9 光合速率及蒸腾速率
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• +/H⁺逆向转运蛋白基因转化元件转化玉米的研究'>4 最小线性Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因转化元件转化玉米的研究
• 4.1 材料与方法:
• 4.1.1 植物材料:
• 4.1.2 外源功能基因:
• 4.1.3 基因转化元件的制备:
• 4.1.4 转化方法:
• 1代转化材料的检测:'>4.1.5 T₁代转化材料的检测:
• 4.2 结果与分析:
• 4.2.1 PCR检测:
• 4.2.2 Southern blot检测:
• 4.3 讨论:
• 4.4 小结:
• 5 玉米子房滴注法的初步研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料:
• 5.1.2 试剂:
• 5.1.3 玉米花粉管通道转化方法:
• 5.1.4 玉米子房滴注转化方法:
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 中性红染色剂实验
• 5.2.2 荧光染色剂（hoechst）实验
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论:
• 6.2 创新点:
• 6.3 有待进一步开展的工作:
• 6.4 展望:
• 参考文献
• 致谢