论文摘要
目的:14-3-3蛋白是一类在真核生物中广泛表达,氨基酸序列高度保守的蛋白家族。近年来研究发现该类蛋白质可以与众多的原癌基因产物和信号分子以及细胞骨架蛋白相结合,从而在细胞信号传导、细胞周期调控、细胞凋亡、基因表达调控等方面起重要的作用。连环蛋白（catenin）是一类起细胞黏附和信号转导作用的细胞内糖蛋白家族。我室以往应用酵母双杂交技术筛选发现14-3-3ε与αN-catenin有较强的相互作用。本研究在确定这两种蛋白组织分布的基础上,用原核表达系统表达GST-14-3-3ε融合蛋白,经GST蛋白沉降技术（ GST pull-down assay）,进一步验证14-3-3ε与αN-catenin之间的相互作用,为探讨14-3-3ε和αN-catenin表达及其相互作用在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）表型转化和细胞骨架重构中的意义奠定基础。方法:1 14-3-3ε和αN-catenin在大鼠不同组织中的表达活性1.1 14-3-3ε和αN-catenin mRNA检测用Trizol一步法提取大鼠血管、脑、肺、心、肝、肾、睾丸、肠、脾共9种组织的总RNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,测定OD260吸收确定其含量后,进行RT-PCR。1.2 14-3-3ε和αN-catenin蛋白水平分析提取大鼠血管、脑、肺、心、肝、肾、睾丸、肠、脾共9种组织的总蛋白后进行Western blot分析。2 14-3-3ε原核表达质粒的构建与鉴定将经RT-PCR获取的14-3-3ε全长cDNA,经EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆到pGEX-4T-1载体中,重组质粒经酶切和测序鉴定正确无误后,命名为pGEX-4T-1-14-3-3ε。3 GST-14-3-3ε融合蛋白的诱导表达及纯化将pGEX-4T-1-14-3-3ε质粒转化E.coli BL21工程菌,对IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化。在最佳条件下诱导转化菌表达外源蛋白后,收集菌体,超声裂菌后收集上清,用GST-Sepharose 4B亲和层析对GST-14-3-3ε融合蛋白进行纯化。4 GST pull-down研究14-3-3ε和αN-catenin之间的相互作用将大鼠血管蛋白提取液与结合有GST-14-3-3ε融合蛋白的GST-Sepharose 4B球珠共同孵育后,取沉淀进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果:1 14-3-3ε和αN-catenin基因在大鼠不同组织中的表达活性RT-PCR结果显示,在转录水平上,14-3-3ε在所检测的9种组织中都有表达,且在血管、肺、肾、睾丸、肠中表达量较高。αN-catenin在各组织中的表达丰度明显低于14-3-3ε,且在肾脏中不可检出。二者在血管均有较高表达。Western blot分析结果显示,蛋白水平上,在所检测的组织中均有14-3-3ε的表达,αN-catenin在血管、脑、睾丸、肠、脾中表达较高。2 pGEX-4T-1-14-3-3ε原核表达质粒的构建酶切鉴定和测序结果显示,重组质粒pGEX-4T-1-14-3-3ε中插入的14-3-3εcDNA长度正确,核苷酸序列无误。3 GST-14-3-3ε融合蛋白的诱导表达转化pGEX-4T-1-14-3-3ε的宿主菌经IPTG诱导后,可表达分子量为54 kD的蛋白质,与预期大小一致。4 GST-14-3-3ε融合蛋白的分离纯化转化菌裂解液经GST-Sepharose 4B亲和层析纯化后,SDS-PAGE可见分子量为54 kD的单一条带。5 14-3-3ε与αN-catenin之间存在物理学上的相互作用GST pull-down分析结果显示,αN-catenin可与GST- 14-3-3ε蛋白结合,但不能与GST蛋白相结合。表明14-3-3ε与αN-catenin可直接进行相互作用。结论:1确立了14-3-3ε和αN-catenin基因在大鼠不同组织中的表达活性。2成功构建了14-3-3ε原核表达质粒pGEX-4T-1-14-3-3ε。3对GST-14-3-3ε融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件进行了优化。4经过对原核表达产物进行GST亲和层析得到电泳纯的GST-14-3-3ε融合蛋白。5 GST pull-down分析证明,14-3-3ε与αN-catenin在体外可直接进行相互作用。