酸枣果肉化学成分及镇静催眠活性研究

论文摘要

酸枣[Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa （Bunge） Hu ex H. F. Chow]为鼠李科枣属植物,在我国分布广泛,蕴藏量大。酸枣仁是传统的镇静安神常用中药。而酸枣果肉作为酸枣仁生产中的副产物目前主要用于生产饮料等食品,在药用方面未有应用。因此,本文对酸枣果肉进行了系统的研究,包括三萜成分的分离鉴定：三萜成分HPLC分析方法的建立：不同产地样品的成分比较；动物镇静催眠活性的研究,7种神经递质LC-MS/MS分析方法的建立；口服给予酸枣果肉后小鼠脑内神经递质的测定.其目的在于为进一步开发利用酸枣果肉这一天然资源提供科学依据。利用硅胶柱层析法,从酸枣果肉的乙酸乙酯部分分离得到了12个三萜类化合物,根据其理化性质和各种光谱,鉴定了其中7个化合物的结构,分别为朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯（3-O-cis-p-Coumaroyl alphitolic acid）,山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯（3-O-cis-p-Coumaroyl maslinic acid）,朦胧木-3-O-顺式-对-香豆酰酯（3-O-trans-p-Coumaroyl alphitolic acid）,山楂酸-3-O-顺式式-对-香豆酰酯（3-O-trans-p-Coumaroyl maslinic acid）,齐墩果酸（Oleanolic acid）,熊果酸（Ursolic Acid）,3-羰基熊果酸（3-O-one-Ursolic Acid）。其余5个化合物的结构还有待于鉴定。首次建立了LC-UV法用于同时测定酸枣果肉中12种三萜类化合物的含量,并比较了不同产地酸枣的指纹图谱。样品以80%乙醇超声提取,以C18色谱柱进行分离,结果显示12个被测成分均有良好的线性,精密度、重复性和回收率良好,均达到分析要求。研究发现来自河北邢台、河南洛宁和北京怀柔的两种不同的酸枣之间的化学成分组成相同,但含量差别较大,其中以河南洛宁产野生酸枣各三萜化合物含量较高。实验证明,此方法方便易行,准确可靠,为酸枣果肉的质量控制提供了可靠的方法。运用多种模型测试了口服给予酸枣果肉80%乙醇提取物后小鼠自主活动和睡眠的改变,以及脑内神经递质的变化。空场和明暗箱穿梭实验结果均显示,酸枣果肉在10g/kg的剂量下可产生显著的减少小鼠自主活动作用（p<0.05）,缩短运动的总路程和减少在明暗室间的穿梭次数,且随剂量的增加,效果加强。在戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠实验中,观察到了酸枣果肉明显的助眠作用,可以明显提高给药小鼠的入睡率,缩短睡眠潜伏期和延长睡眠时间。尽管在10和20g/kg的剂量下,对睡眠没有产生显著性影响,但有明显的改善趋势,而在30g/kg的剂量下助眠作用显著（p<0.01）。同时检测小鼠脑内神经递质的含量变化结果发现,口服酸枣果肉后小鼠脑内7种神经递质的变化趋势与给予舒乐安定后的变化趋势一致,其中与睡眠有关的抑制性神经递质5-HT明显升高。上述结果均说明酸枣果肉具有镇静催眠活性。首次建立了一种灵敏可靠的LC-MS/MS分析方法,用于同时测定脑内7种神经递质,包括多巴胺（DA）,肾上腺素（E）,去甲肾上腺素（NE）,5-羟色胺（5-HT）,乙酰胆碱（Ach）, γ-氨基丁酸（GABA）,谷氨酸（Glu）。方法学考察表明其线性良好、精密度、准确度、稳定性均符合实验要求。通过测定小鼠腹腔注射多奈哌齐和东莨菪碱后脑内神经递质的变化,验证了此方法的可靠性。该方法为神经递质的研究提供了一个新的高效便捷的手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 酸枣的化学成分及药理作用研究进展
• 1.1 酸枣仁的化学成分
• 1.1.1 三萜类化合物
• 1.1.2 黄酮类化合物
• 1.1.3 脂肪酸类化合物
• 1.1.4 甾体化合物
• 1.1.5 生物碱类化合物
• 1.2 酸枣果肉的主要化学成分
• 1.2.1 三萜类化合物
• 1.2.2 油脂类
• 1.3 酸枣根的化学成分研究
• 1.4 酸枣仁的药理作用
• 1.4.1 镇静催眠作用
• 1.4.2 抗焦虑及抑郁
• 1.4.3 抗氧化抗衰老
• 1.4.4 其他作用
• 1.4.5 毒性研究
• 1.5 酸枣果肉的营养及生物活性
• 1.5.1 酸枣果肉的营养价值
• 1.5.2 酸枣果肉的生物活性研究
• 1.6 酸枣叶的生物活性
• 1.7 酸枣根的生物活性
• 1.8 本研究的目的和意义
• 2 酸枣果肉化学成分分离
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器与试剂
• 2.1.2 植物来源与鉴定
• 2.2 提取与分离
• 2.3 化合物的波谱解析及实验数据
• 2.3.1 化合物1
• 2.3.2 化合物2
• 2.3.3 化合物3
• 2.3.4 化合物4
• 2.3.5 化合物9
• 2.3.6 化合物10
• 2.3.7 化合物12
• 2.4 讨论
• 3 酸枣果肉中三萜类化学成分的含量分析
• 3.1 仪器与试药
• 3.1.1 仪器设备
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 供试样品来源与鉴定
• 3.2 方法与结果
• 3.2.1 对照品溶液的制备
• 3.2.2 HPLC方法的建立
• 3.2.3 标准溶液的制备
• 3.2.4 标准曲线
• 3.2.5 供试品溶液的制备
• 3.2.6 检测波长的选择
• 3.2.7 提取溶剂的选择
• 3.2.8 提取时间的选择
• 3.2.9 方法学考察
• 3.2.10 不同产地酸枣果肉中三萜成分的含量比较
• 3.3 讨论
• 4 酸枣果肉药效学研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 药品与试剂
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法与结果
• 4.2.1 酸枣果肉提取物的制备
• 4.2.2 对自主活动的影响
• 4.2.3 对戊巴比妥钠催眠作用的影响
• 4.2.4 口服给予酸枣果肉后小鼠脑内神经递质的变化
• 4.2.5 数据处理
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 神经递质LC-MS/MS检测方法的建立
• 5.1 材料
• 5.1.1 药品和试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 动物
• 5.2 方法
• 5.2.1 色谱条件
• 5.2.2 质谱条件
• 5.2.3 标准储备液的配制
• 5.2.4 脑样品的采集和处理
• 5.2.5 标准溶液的配制
• 5.2.6 动物验证试验
• 5.2.7 数据处理
• 5.3 方法学验证
• 5.3.1 精密度
• 5.3.2 准确度
• 5.3.3 稳定性
• 5.3.4 最低检测限
• 5.4 结果
• 5.4.1 神经递质LC-MS/MS检测方法
• 5.4.2 线性及最低检测限
• 5.4.3 精密度和准确度
• 5.4.4 稳定性
• 5.4.5 动物验证实验
• 5.5 讨论
• 5.5.1 LC-MS/MS检测条件的确定
• 5.5.2 样品处理方法的确定
• 5.6 小结
• 6 结论
• 7 参考文献
• 致谢
• 附图