道地药材研究模型“丹参毛状根”的评价研究

论文摘要

作为中医药的精髓,药材的道地性既有来源于历史和文化的属性,又涉及到遗传、环境及生产实践等方方面面。从生物学上说“道地药材”的形成是基因型与环境之间相互作用的产物,可用公式表示:表型=基因型+环境饰变。道地药材是一个复杂系统,它的每一个因素及其相互作用不可能都被同时考察,研究中必须有所取舍,对研究对象降阶降维,才有可能取得突破。环境因子究竟是如何通过修饰道地药材的基因型而发生作用的,生态因子与道地药材次生代谢产物积累的有着怎样的关系,至今缺少直接和系统的实验研究。至此,科学模型因其具有简化复杂研究对象的特点,开始引起道地药材研究者的关注,构建道地药材研究模型（载体）,成为道地药材生物学研究的关键。模型在生物学中的应用相当广泛。通过在基本原型的基础上建立相关的模型,并运用相应的模型分析解释生物学现象、揭示生物本质规律特征,研究某种动态生命系统中各种因子之间相互关系。作为现代生命科学研究不可缺少的重要手段,模型和模型方法很早就已经渗透到生命科学研究的各个环节,例如用于基因工程研究的模式物种,用于医学实验的动物模型等。毛状根培养是80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项新技术,它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA转化到植物细胞的DNA上,诱导植物细胞产生毛状根。毛状根作为一种有效的长期保持物种优良性状的方式,越来越多的被人们作为实验材料,同时获取次生代谢产物。毛状根具有生长速度快,且不受气候、病虫害、地理和季节的限制等特点。据不完全统计,国内外目前已对29科52种药用植物进行了毛状根诱导的研究,建立了长期的毛状根培养系统,获得次生代谢产物。本论文针对目前道地药材生物学本质研究中需要解决的问题,在本实验室开展工作的基础上,选取丹参毛状根作为研究对象,对其是否具备道地药材研究模型的特性进行了系统的评价研究。即毛状根到底能不能作为模型来研究道地药材?能不能再现原植物药材的特性,是否能作为稳定的可重复的研究工具等。该模型的评价研究,涉及到植物化学、分子生物学、药理学等许多层面。主要包括三个方面:①再现性,作为研究道地药材的模型要考察毛状根和其原型（即原药材）之间的相似性,包括化学成分,毒性以及药效等,来阐明毛状根是否具有再现原药材的特性。②稳定性,毛状根的核DNA的稳定性、rol基因遗传稳定性、化学成分稳定性等。③实用性,在证明毛状根模型具有稳定性和再现性的基础上,对其作为模型的实用性进行了研究,考察毛状根是否便于取材,是否具备优良的实验物性,作为模型是否易于建立和使用。1丹参毛状根模型的再现性研究（与原植物的相似性）1.1化学成分的相似性选取药典中的指标成分丹参酮ⅡA和丹酚酸B,对丹参毛状根和河北丹参药材进行了含量测定,丹参药材中丹参酮ⅡA含量为0.12%,丹酚酸B含量为5.4%;各个批次的毛状根丹参酮ⅡA的含量在0.04%～0.10%之间,平均值与药材相比较低;丹酚酸B的含量在3.21%～7.25%,平均值与药材相比较高。同时,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行相似度分析,对毛状根与药材的指纹图谱也进行了比较,相似度在0.948以上,说明丹参毛状根的化学成分组成与2个产地（河北灵寿,四川中江）的丹参药材相比差异不显著。由此可见,丹参毛状根与丹参药材具有相似的化学成分。1.2急性毒性丹参毛状根提取物LD50为63.94g生药/kg,95%可信区间为（58.82～69.51）g生药/kg。按公斤体重计算相当于成人日摄入量（丹参临床人用剂量为9～15g/日,0.25g生药/kg）的255.76倍。结果表明,丹参毛状根最大无毒剂量已超过人临床用药量的100倍。1.3药效的相似性丹参根为传统的“活血化瘀”中药。其各种制剂应用于冠心病与心血管病治疗收到了良好的效果。本实验从整体、器官以及细胞三个水平上观察丹参毛状根对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。①整体实验表明,丹参毛状根组能显著降低缺血再灌注所致VT,VF的发生率,降低血浆LDH,MDA含量,提高SOD活性;与丹参药材相比无显著性差异。②离体实验发现,丹参毛状根能够增加冠脉流量,不但降低心律失常的发生率,而且推迟心律失常的发生时间,缩短持续时间和恢复时间,对LDH,MDA和SOD的释放有明显的改善作用,结果提示丹参毛状根处理对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤可能具有保护作用;与丹参药材相比无显著性差异。③细胞实验表明,丹参毛状根可较显著增加H/R心肌细胞的存活率,降低MDA含量,提高SOD活性。各组随剂量增大LDH,MDA含量减少,SOD活性增加,丹参毛状根可拮抗大鼠心肌细胞H/R损伤,对大鼠心肌细胞H/R损伤可能具有保护作用;与丹参药材相比无显著性差异。上述研究表明,丹参毛状根与丹参药材对心肌缺血再灌注损伤的保护作用相当。2丹参毛状根模型的稳定性研究2.1核DNA的稳定性通过流式细胞仪对丹参毛状根核DNA浓度的分析,选取大豆作为内参物,结果表明所选取的5批丹参毛状根样品,核DNA含量平均为0.18pg/2C,基因组大小平均为87.8 Mbp,RSD为6.6%,核DNA的浓度比较稳定。2.2 rol基因的稳定性从随机培养的丹参毛状根中任选10批,提取新鲜组织的DNA,并进行PCR扩增,结果表明,外源基因rolA在10批样品的基因组DNA中均可以检测到,并将rolA基因作为目的基因进行了回收测序与GeneBank登录序列（X12579）的同源性为100%。由此可以说明10个批次的丹参毛状根样品中rol基因是稳定的。2.3化学成分的稳定性通过对丹参毛状根的指纹图谱研究,对其化学成分的稳定性进行了分析。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行相似度分析,从计算结果可以看出,10批毛状根的相似度均在0.970以上,说明不同批次丹参毛状根样品间化学成分组成的差异不显著。同时,通过对不同批次的丹参毛状根的生长情况的分析表明,不同批次生长率无显著性差异,比较稳定。3丹参毛状根模型的实用性研究3.1丹参毛状根的生长周期研究6,7-V培养基上培养丹参毛状根,分别在第2,4,6,8,10周收获,测定其生长量。高效液相色谱法测定丹参毛状根中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量。在固体培养基中培养的毛状根,收获时应选择6周比较合适,此时毛状根的增长倍数大,有效成分相对来说也比较高。由此可见,丹参毛状根培养周期短,6-8周即可收获,具有快速繁殖的特性,并能迅速积累次生代谢产物。3.2矿质营养元素对丹参毛状根生长和有效成分积累的影响本实验通过在6,7-V培养基的矿质营养元素配方基础上进行加减,深入研究了培养基中氮、钾、铁、镁4种单一矿质营养元素的浓度,对丹参毛状根生长和有效成分积累的影响。结果表明,氮元素对毛状根的生长影响最大,其次是钾元素。铁元素和镁元素对丹参毛状根的生长量影响不大。从有效成分含量的积累来看,低氮以及完全处理组的铁和镁元素有利于丹参酮ⅡA的累积。高氮,高钾有利于丹酚酸B的积累。培养基中这4种元素浓度的改变都会对毛状根产生不同程度的刺激,进而影响其生长和有效成分的积累,由此证明丹参毛状根对矿质营养元素的刺激具有灵敏性,因此,可以用毛状根作为模型进行更深一步的道地产区环境因子变化的分析研究。结论本论文的研究结果表明:丹参毛状根具有良好的再现原药材的特性,可以替代原药材作为研究模型,各个批次遗传、化学比较稳定,取材方便,生长繁殖快,具有优良的实验物性,作为模型具有一定的实用性。通过对丹参毛状根的评价研究,认为毛状根可以作为研究模型。用毛状根为模型,可以以道地药材表型与生境及基因型的相互关系为切入点,深入研究道地药材对环境的响应,基因的功能、表达的调控机制等。本论文首次提出道地药材研究模型,并系统的对毛状根作为模型进行评价,为道地药材的研究提供实验平台,是本论文的创新点。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 道地药材研究模型的构建
• 1 道地药材研究模型构建的必要性和意义
• 1.1 道地药材的生物学本质研究
• 1.2 道地药材研究模型构建的必要性和意义
• 2 模型及模型方法
• 2.1 模型及模型方法的含义
• 2.2 模型的特点
• 3 道地药材研究模型的建立
• 4 本论文的研究思路
• 参考文献
• 第二章 药用植物毛状根的研究进展
• 1 研究概况
• 2 研究内容
• 2.1 生产次生代谢产物
• 2.2 作为基因工程的载体诱导转基因植株
• 2.3 毛状根药理药效研究
• 3 展望
• 3.1 提高毛状根产量
• 3.2 提高毛状根次生代谢产物
• 3.3 提高毛状根转化效率
• 参考文献
• 实验部分
• 第三章 丹参毛状根模型的再现性研究（与原植物的相似性）
• 第一节 丹参毛状根与丹参药材化学成分的比较
• 1 材料
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二节 丹参毛状根的急性毒性研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三节 丹参毛状根与丹参药材提取物对大鼠冠脉结扎致心肌缺血的实验研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四节 丹参毛状根与丹参药材提取物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第五节 丹参毛状根与丹参药材提取物对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 本章小结
• 第四章 丹参毛状根模型的稳定性研究
• 第一节 用流式细胞仪测定丹参毛状根遗传稳定性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二节 rol基因的遗传稳定性研究
• 1 材料
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三节 不同批次丹参毛状根化学成分稳定性研究
• 1 材料
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 本章小结
• 第五章 丹参毛状根模型的实用性研究
• 第一节 丹参毛状根生长周期研究
• 1 材料
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 第二节 矿质营养元素对丹参毛状根生长和有效成分积累的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 本章小结
• 论文结论
• 附录
• 致谢
• 作者简历