含O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建与表达

论文摘要

口蹄疫（foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病;羊痘（capripox,CP）是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。口蹄疫和羊痘均因危害严重而被世界动物卫生组织列为A类重大传染病。痘苗病毒（fowl pox viruses , FPV）载体是研究最早和最成功的载体病毒之一,具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区等优势,有利于进行基因工程操作和插入多个外源基因,且抗原性稳定、免疫原性持久,能够同时诱发体液和细胞免疫,相对安全。本文利用我国广泛使用的山羊痘疫苗弱毒株（AV41）,以胸腺嘧啶核苷激酶基因（TK）为突破点,利用病毒在细胞内的同源重组,构建表达O型FMDV P1-2A、3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株。构建一个能够同时预防口蹄疫和羊痘病毒的活载体疫苗。（1）利用RT-PCR分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,得到重组载体pUC119-P1-2A,pMD18-T-3C。将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHI酶切、重组载体pMD18-T-3C用BamHI、NheI酶切,利用酶切所得基因片段P1-2A、3C有共同的BamHI酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C。然后将基因P1-2A-3C与启动增强型绿色荧光蛋白（ Enhanced Green fluorescent protein ,EGFP）表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建了包含真核基因表达元件和筛选标记基因的表达盒载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C。以kpnⅠ为插入位点,将整体表达盒插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中,构建了共表达FMDV P1-2A-3C基因和绿色荧光蛋白基因的重组山羊痘病毒转移载体pUC119-TK-P7.5-EGFP-P1-2A-3C。（2）病毒转移载体pUC119-TK -EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C转染GTPV AV 41株感染的BHK-21细胞,转染后18～24h就可见到特异性荧光。经EGFP筛选重组病毒,RT-PCR检测FMDV P1-2A-3C基因,抗原捕获ELISA检测FMDV抗原,结果表明,成功获得能稳定、正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK+/EGFP+/ FMDV P1-2A-3C+/GTPV。本研究采用羊痘病毒弱毒株为基因工程活载体表达FMDV P1-2A-3C基因,为预防羊的烈性传染病口蹄疫和羊痘开创了新的思路。研究中构建的羊痘病毒活载体,将为反刍动物疾病基因工程活载体疫苗的研究提供技术、资源支持。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一篇 文献综述
• 第一章 口蹄疫病毒
• 1 口蹄疫概述
• 2 发病机理
• 3 病理变化
• 3.1 眼观变化
• 3.2 病理组织学变化
• 4 口蹄疫病毒及其基因组
• 第二章 羊痘病毒的研究进展
• 1 羊痘的流行概况
• 2 病原 SPPV 和 GTPV
• 3 SPPV 、GTPV 和 LSDV 基因组
• 4 P32 结构蛋白
• 5 胸腺嘧啶核苷激酶基因（TK 基因）
• 6 羊痘发病机理
• 7 羊痘病毒病理变化
• 8 羊痘活载体疫苗研究进展
• 第三章 疫苗研究中应用的载体病毒
• 1 痘病毒载体
• 2 腺病毒
• 3 脊髓灰质炎病毒
• 4 疱疹病毒
• 5 其它病毒
• 第二篇 实验部分
• 第一章 含O 型FMDV P1-2A、3C 基因和EGFP 基因表达盒的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株与载体
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 FMDV 总 RNA 的提取
• 1.2.3 P1-2A 及3C 基因 RT-PCR 扩增
• 1.2.4 转移载体骨架的构建
• 1.2.5 重组载体pMD18-T-P1-2A-3C 的构建
• 1.2.6 p-EGFP-N1-P-7.5-P1-2A-3C 表达盒的构建
• 2 结果
• 2.1 P1-2A 及3C 基因 RT-PCR 扩增产物
• 2.2 pUC119-P1-2A 重组载体酶切鉴定和PCR 鉴定
• 2.3 pMD18-T-3C 重组载体酶切鉴定和PCR 鉴定
• 2.4 重组载体pMD18-T-P1-2A-3C 酶切鉴定和PCR 鉴定
• 2.5 p-EGFP-N1-P-7.5-P1-2A-3C 表达盒酶切鉴定和PCR 鉴定
• 3 讨论
• 第二章 表达含EGFP 基因FMDV P1-2A-3C 的山痘病毒复制非必需区TK 转移载体的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 病毒
• 1.1.2 菌种、载体
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 重组载体pUC119-TK 的构建
• 1.2.2 转移载体pUC119-TK-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C 的构建
• 2 结果
• 2.1 重组质粒pUC119-TK 的酶切和PCR 鉴定
• 2.2 转移载体pUC119-TK-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C 的鉴定BglⅡ酶切和PCR 鉴定
• 3 讨论
• 第三章 O 型口蹄疫病毒P1-2A 3C 基因的山羊痘病毒弱毒株的表达及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 毒株和细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 GTPV AV41 株BHK-21 细胞传代
• 1.2.2 GTPV AV41 与脂质体共转染BHK-21 细胞
• 1.2.3 重组病毒的筛选
• 1.2.4 RT-PCR 检测目的基因
• 1.2.5 ELISA 检测目的表达抗原
• 2 结果
• 2.1 GTPV AV41 感染BHK-21 细胞后的病变图
• 2.2 重组CPV 的筛选
• 2.3 重组 CPV 感染的细胞培养物RT-PCR 鉴定
• 2.4 重组 CPV 在 BHK21 细胞中 FMDV P1-2A-3C 表达双抗夹心ELISA 检测
• 3 讨论
• 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介