小鼠干扰素λ3的表达及其生物学活性初步研究

论文摘要

根据氨基酸序列和受体的差异,干扰素（IFN）分为I型、II型和新发现并命名归类的III型。IFN-λ3（又名IL-28B）是2003年发现的III型IFN-λ家族成员中的一员。跟其一起发现还有结构类似的IFN-λ1（又名IL-29）、IFN-λ2（又名IL-28A）。IFN-λ3基因结构与IL-10类似,氨基酸水平却与IFN接近。小鼠的IFN-λ家族仅发现2个成员,即IFN-λ2和IFN-λ3。研究发现mIFN-λ3 mRNA表达于小鼠血液细胞、肺、胰腺、胎盘、脑等多种组织中,其表达受病毒感染的外周血单个核细胞、树突状细胞和肿瘤细胞等的刺激诱导。自1957年IFN被发现以来,有关IFN的研究就不断深入。I型IFN已被认可临床应用于多种肿瘤和病毒性疾病的治疗,但其疗效往往很有限而且对于不同疾病差异较大,且常出现疲劳、发热等不良反应。新发现的IFN-λs的功能与I型IFN相似,但其受体跟I型IFN的受体却有所不同,极有可能替代I型IFN应用于临床治疗。IFN-λs的受体在人体中的分布不同于I型IFN,使得其能选择性作用于不同靶细胞、靶基因并发挥其独特生物学活性。本研究用分子生物学技术构建小鼠IFN-λ3的原核及真核表达载体、进行原核和真核表达系统表达mIFN-λ3蛋白以及对其生物学功能的初步研究,为进一步研究其功能奠定了基础。本文主要研究内容如下:一、根据GenBank中小鼠IFN-λ3基因序列（AY869696）设计特异性引物,用聚合酶链式反应（PCR）技术,克隆出mIFN-λ3基因的全长编码区。将其克隆入pcDNA3.1（+）载体,构建其真核表达载体pcDNA3.1（+）-mIFN-λ3。二、根据小鼠IFN-λ3基因序列设计出一对特异性引物,用PCR技术,从购置的表达克隆质粒（EX-Mm18539-M03）中克隆出mIFN-λ3成熟蛋白编码区,将其克隆入载体pET-44（+）,构建原核表达载体pET-44-mIFN-λ3,经测序鉴定其编码基因与GenBank中小鼠IFN-λ3基因序列（AY869696）一致。将该表达载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）中获得表达菌株,然后在25°C用IPTG诱导,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。三、利用已构建好的真核表达重组质粒pcDNA3.1-mIFN-λ3在293细胞中表达。使用MTT法检测表达产生的mIFN-λ3目的蛋白对肿瘤细胞A549和SW620细胞的生长影响,并通过在A549、SW620细胞中诱导MxA抗病毒蛋白的产生研究mIFN-λ3的抗病毒机制。结果发现mIFN-λ3具有抗肿瘤细胞增殖效应,且其抗病毒分子机制可能与诱导肿瘤细胞产生MxA抗病毒蛋白有关。总之,本实验探讨了mIFN-λ3基因的克隆、原核与真核表达载体的制备和原核真核表达、及对mIFN-λ3蛋白抗肿瘤细胞增殖与抗病毒分子机制的初步探讨,为进一步进行mIFN-λ3的理论研究及临床应用研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 前言
• 1 干扰素（IFN）λs的发现与命名
• 2 IFN-λs的分子结构和编码蛋白
• 3 IFN-λs的产生及调节
• 4 IFN-λs的受体及信号传导
• 5 IFN-λs的生物学活性
• 5.1 IFN-λs的抗病毒作用
• 5.2 IFN-λ家族的抗细胞增殖作用
• 6 本研究的目的和内容
• 参考文献
• 第1章 小鼠IFN-λ3 的原核表达、鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增m IFN-λ3 目的片段
• 3.2 表达质粒构建
• 3.3 菌落PCR鉴定
• 3.4 重组质粒的酶切法鉴定
• 3.5 重组质粒的序列分析
• 3.6 融合蛋白的诱导表达
• 4 讨论
• 参考文献
• 第2章 小鼠干扰素λ3 真核
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 m IFN-λ3 基因在293 细胞中表达的鉴定
• 3.2 mIFN-λ3 对A549、SW620 细胞生长的影响
• 3.3 mIFN-λ3 诱导产生MxA蛋白
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 个人简历及学习成果