人脐血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

论文摘要

目的从人新鲜脐带血中分离内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。采用parcoll密度梯度离心法从脐血中分离出内皮祖细胞（EPCs）,将分离出的细胞进行纯化,并在体外利用脐血进行培养,采用流式细胞术及因子相关抗原免疫染色对培养出的细胞进行鉴定。结果表明可以观察到生长状态良好的EPCs。人脐血中可以分离、培养内皮祖细胞,有利于内皮祖细胞的进一步研究及临床应用。方法采用密度梯度离心法获得脐带血单个核细胞,然后分别用含胎牛血清M199培养液和含自体血清M199培养液进行体外诱导、分化和扩增,观察贴壁细胞在诱导分化中的形态学变化,通过免疫组化、免疫荧光和流式细胞仪等技术从不同角度对贴壁细胞进行鉴定。结果1.在培养1到2天后可见脐血单个核细胞贴壁;纺锤形状的细胞一般在3天过后出现,以后贴壁细胞逐渐增多,并逐渐变成梭形;当细胞培养至一周时,形成周围为梭形细胞,中央主要为圆形细胞的典型集落;10d后,可观察到梭形细胞首尾相连出现典型的线样排列结构;细胞培养至一个月时,互相连接细胞簇开始连接形成网样结构。随着培养时间的增加,长梭形细胞逐渐缩短,并呈现出典型铺路石样改变。2.贴壁细胞培养至一周后观察,铺有纤维连接蛋白的培养基内的细胞明显比没有铺有纤维连接蛋白的细胞多（t=8.25,P<0.01）。3.免疫组化显示:CD31、vWF抗原免疫组化在刚分离的单个核细胞上表达阴性;单个核细胞培养至2周后,FCS-M199培养的贴壁细胞CD31阳性表达率为:（88.62±3.74）%,vWF阳性表达率为:（73.36±3.88）%。AS-M199培养的贴壁细胞CD31阳性表达率为:（86.81±4.26）%,vWF阳性表达率为:（ 73.14±3.54）%。4.免疫荧光染色表明:细胞培养至第7天,FCS-M199培养的贴壁细胞中双染阳性率为（85.04±3.56）%,并且DiI-acLDL标记的EPCs红色荧光在体外可以持续6W以上;AS-M199培养的贴壁细胞中双染阳性率（82.33±4.57）%。5.流式细胞仪分析显示:第1周测定贴壁细胞表面标志CD34、CD133和KDR分别为:25.37%±5.52%%、45.78%±6.39%、77.75%±7.50%;2周的流式细胞仪分析显示CD133阳性率为0, CD34和VEGFR2表达率分别为55.13%±7.54%、84.57%±5.14%。结论1.通过密度梯度离心法从脐带血分离单个核细胞,再用VEGF、bFGF、BPE等因子诱导培养,以VEGFR-2、CD133及CD34为标志物,是获得血管内皮祖细胞的一个简单可行的方法。2.加入FN可促进EPC的贴壁生长。3.可以用AS-M199培养基替代FCS-M199培养基培养EPCs。4.以DiI-acLDL标记的EPCs红色荧光表达可持续6周以上,并且此方法简便、可行,不容易被污染,所以,DiI-acLDL是体内移植EPCs较为理想的示踪物。5.以往实验发现单个核细胞不容易贴壁,本实验发现加入纤维连接蛋白促进内皮细胞贴壁,加入纤维连接蛋白组细胞密度明显多于未加入纤维连接蛋白组的细胞密度（t=7.45,P<0.01）,有显著性差异。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 在校期间的科研成果
• 致谢
• 个人简介