抗蚜虫PPA基因的小麦转化

论文摘要

近年来植物转基因技术研究发展迅速,大豆和棉花等转基因作物已大面积推广应用,取得了巨大的经济与社会效益。小麦是世界主要的粮食作物,1992年第一株转基因小麦诞生,为开展小麦分子育种奠定了基础。本课题针对目前小麦转基因中存在的低转化率、栽培品种少、抗虫基因单一等问题,拟利用掌叶半夏凝集素（Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA）基因转化小麦,建立较成熟的小麦栽培品种抗蚜虫基因的转化体系。本文选用了“石4185”、“扬麦12”等7个小麦品种,研究了品种、激素等条件对小麦愈伤组织诱导及分化的影响,并通过检测GUS基因的瞬时表达情况,研究了基因枪介导法的主要参数对转化效率的影响。将含有抗蚜虫基因（PPA基因）和GUS报告基因的质粒载体导入小麦愈伤组织,在含潮霉素的选择培养基上进行筛选、分化及壮苗,获得了抗性植株。实验结果表明,最适的转化受体是幼胚诱导的胚性愈伤组织,轰击前6小时及轰击后18小时将愈伤组织置于含甘露醇0.4 mol?L-1的高渗培养基上进行高渗处理有助于提高转化率,当轰击压力为1 100 psi,质粒1μg/枪及金粉300μg/枪时,GUS瞬时表达率及表达量最高。将已轰击愈伤组织在含2 mg?L-1的2,4-D的恢复培养基上恢复培养5天至7天能有效提高愈伤组织的植株再生能力。用60 mg?L-1的潮霉素筛选30天后可以获得抗性愈伤组织,经过检测抗性愈伤组织中GUS基因稳定表达。在KT浓度为1 mg?L-1且NAA浓度为0.1 mg?L-1至0.5 mg?L-1的分化培养基中分化出绿色芽点,并诱导成苗。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 蚜虫的防治方式
• 1.1.1 药剂防治
• 1.1.2 常规育种方法
• 1.1.3 利用基因工程获得抗虫转基因小麦
• 1.2 抗蚜虫基因
• 1.2.1 来源于细菌的抗虫基因
• 1.2.2 来源于动物体的毒素基因
• 1.2.3 来源于植物的抗虫基因
• 1.3 常用转化方法
• 1.3.1 基因枪介导法
• 1.3.2 农杆菌介导法
• 1.4 小麦抗蚜虫转基因中存在的问题及对策
• 1.4.1 提高小麦转化效率
• 1.4.2 扩大受体基因型的范围
• 1.4.3 挖掘与利用具有重要价值的新基因
• 1.5 研究课题的来源
• 1.6 课题的目的和研究内容
• 1.6.1 课题的研究目的
• 1.6.2 课题的研究内容
• 第2章 转化受体的获得
• 2.1 概述
• 2.2 材料、试剂与设备
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 实验设备与仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 MS 基本培养基及其配制
• 2.3.2 愈伤组织诱导及分化培养基
• 2.3.3 小麦愈伤组织的获得
• 2.3.4 数据处理
• 2.4 结果
• 2.4.1 胚性愈伤组织诱导结果
• 2.4.2 不同小麦品种幼胚出愈率比较
• 2.4.3 不同小麦品种分化能力的比较
• 2.4.4 幼胚愈伤组织与成胚愈伤组织分化能力的比较
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小节
• 第3章 基因枪法介导的小麦转化
• 3.1 概述
• 3.2 材料、试剂与设备
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 实验设备与仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 转化受体高渗处理
• 3.3.2 提取含目的基因的质粒DNA
• 3.3.3 质粒DNA 的检测
• 3.3.4 基因枪转化
• 3.3.5 恢复培养
• 3.4 结果
• 3.4.1 高渗处理对小麦基因转化的影响
• 3.4.2 不同转化受体对小麦基因转化的影响
• 3.4.3 轰击压力轰击距离对小麦基因转化的影响
• 3.4.4 单双枪对小麦基因转化的影响
• 3.4.5 恢复培养对小麦基因转化的影响
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小节
• 第4章 筛选与分化
• 4.1 概述
• 4.2 材料、试剂与设备
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验试剂
• 4.2.3 实验设备与仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 筛选剂用量的选择
• 4.3.2 筛选方式对筛选效果的影响
• 4.3.3 抗性愈伤组织的分化成苗
• 4.4 结果
• 4.4.1 筛选剂用量的选择
• 4.4.2 筛选方式对筛选效果的影响
• 4.4.3 转化愈伤组织筛选后GUS 染色结果
• 4.4.4 抗性愈伤组织的植株再生
• 4.4.5 阳性植株分子检测
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小节
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢