论文摘要
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)包括克罗恩病(Crohn’sdisease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC),是以肠道免疫功能紊乱为主的非特异性炎性疾病。IBD好发于青壮年,往往是发作—缓解—复发的模式,严重影响生活质量,且长期治疗耗费巨大。在国内,IBD的发病率和患病率尚缺乏大规模的流行病学调查,但报道显示呈明显的上升趋势,基于多家医院病例统计推测,UC与CD的患病率分别为11.6/105和1.4/105,且有被低估之虞。而我们研究小组对我院确诊的IBD患者进行了统计,发现确诊的IBD 10年来增加了5倍。在炎症性肠病的药物治疗中,免疫抑制剂如硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA),6-巯嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)等有着不可替代的作用。循证医学证明免疫抑制剂能有效诱导和维持IBD的缓解,并减少激素依赖。但是AZA和6-MP的治疗存在很大的个体差异。在活动期患者的治疗中,约2/3的患者能诱导缓解,15%患者完全无效,而约有9-28%的患者在治疗过程中发生了严重的副反应,如骨髓抑制和肝脏毒性。药物个体疗效的不确定性和对于药物严重毒副作用的顾虑都限制了AZA及6-MP在IBD患者中的使用,因而降低了IBD患者的治疗质量,在国内这一矛盾尤其突出。AZA类药物治疗的个体差异与其代谢途径密不可分。AZA及6-MP本身均无活性,必须经过体内一系列酶代谢途径,最终生成活性产物6-硫基鸟嘌呤核苷酸(6-thioguanine nueleotides,6-TGNs)而产生细胞毒效应而发挥疗效,但亦是骨髓抑制的主要原因。而硫嘌呤甲基转移酶(thiopurine S-methyltransferase,TPMT)是AZA及6-MP药物代谢途径中重要的代谢酶,竞争性抑制6-TGNs的生成,并与AZA类药物毒副作用及疗效有着重要关系。1980年Weinshiboum首先报道高加索人种中TPMT的活性具有多态性。高加索人种中TPMT活性呈三态分布,大约0.3%的高加索人为TPMT酶活性减低或缺乏,11.1%酶活性中等,88.6%呈正常或高活性。当接受推荐剂量的AZA类药物治疗时,若TPMT活性降低或缺乏,会生成过多的6-TGNs,骨髓抑制的风险就会大大增加;若TPMT活性过高,一方面不能生成足够的6-TGNs,达到有效的治疗效果,另一方面,会生成过多的6-甲基巯嘌呤核糖核酸(6-methylmercaptopurinenucleotides,6-MMPR),可能导致肝脏毒性的发生。TPMT基因多态性是TPMT活性差异的遗传基础。TPMT基因突变导致TPMT活性下降。研究显示,TPMT表型与基因型检测结果的一致率达到了98.4%。TPMT野生纯合子对应于TPMT高活性,突变杂合子对应于TPMT中等活性,突变纯合子对应于TPMT活性缺乏。目前已发现20余种TPMT突变等位基因(*2,*3A,*3B,*3C,*3D,*4-*19)可能与酶活性降低和/或AZA类药物毒副作用有关。其中在高加索人种中TPMT*2(G238C),*3A(G460A及A719G),*3B(G460A),*3C(A719G)四种突变最为常见,占了约95%。TPMT多态性具有很大的种族差异。目前对于中国汉族健康人群TPMT活性分布及TPMT基因多态性分布情况已见报道,汉族健康人群的TPMT最主要的突变等位基因为TPMT*3C,突变等位基因的频率低于高加索人种;而TPMT活性呈正态分布,均与高加索人种有很大差异。而且对于汉族IBD患者基因多态性分布情况,TPMT基因多态性及酶活性与药物毒副作用及疗效的关系目前均缺乏相关研究。因此为了了解中国IBD患者的治疗现状,研究中国汉族IBD患者TPMT基因多态性分布状况及其与健康人群分布差异,以及TPMT遗传多态性与药物毒副作用及疗效的关系,从而提高用药安全性,建立个体化治疗方案,我们设计了以下四个步骤的研究。首先,为了了解IBD的治疗现状,我们进行了以医院为基础的IBD患者治疗现状的回顾性研究。对收治浙江大学医学院附属邵逸夫医院的177例IBD患者(71例CD,106例UC)的临床特征及药物治疗包括5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、灌肠、免疫抑制剂的治疗情况进行了分析,并建立了IBD患者数据库软件系统。结果发现部分IBD患者没有得到指南所推荐的治疗。27.8%的重度患者未得到静脉或口服糖皮质激素的治疗。远端或左半结肠炎患者只有54.4%的患者给予了灌肠治疗,美沙拉嗪灌肠治疗使用率更低。特别是免疫抑制剂的使用率低下,在有使用免疫抑制剂治疗适应症的患者中,只有19.6%接受了免疫抑制剂的治疗,且药物剂量不足。中国IBD患者免疫抑制剂的低使用率源于临床缺乏该类药物安全性的检测手段,如TPMT基因多态性的检测。那么作为有潜在使用AZA治疗可能的人群,中国IBD患者TPMT基因多态性的分布如何,是否与健康人相近呢?第二步,我们运用引物特异性多聚酶链反应(allele-specific polymerase reaction chain)及多聚酶链反应—限制性片段长度多态性分析(polymerase reaction chain-restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法,对来自中国浙江地区的189例IBD患者及273例健康汉族人进行了TPMT基因单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms,SNPs)检测。结果发现中国汉族IBD患者和健康人群存在的最主要的TPMT突变等位基因为TPMT*3C,未发现TPMT*2,TPMT*3A,TPMT*3B突变存在。健康汉族人群TPMT*3C突变等位基因频率为1.47%,总的突变等位基因频率低于高加索人种。IBD患者TPMT*3C突变等位基因频率1.59%,与健康对照组相近(p=1.000)。UC组TPMT*3C突变等位基因频率为2.45%,高于CD组(0.57%),但两组之间分布比较无统计学差异(p=0.147)。了解了中国汉族IBD患者TPMT基因多态性分布情况后,我们发现该人群突变等位基因频率低于高加索人种。这一结果是否预示着中国汉族IBD患者使用AZA治疗更安全,药物毒副作用发生率低呢?在临床中AZA类药物的安全性到底如何,TPMT基因多态性与AZA药物毒副作用的相关性如何,是否可以通过基因多态性检测来预测AZA的药物毒副作用呢?为解决这一问题,我们进行了TPMT*2,*3A,*3B,*3C突变等位基因与AZA药物毒副作用的相关性研究。第三步,我们对43例接受AZA维持治疗的IBD患者监测骨髓抑制及肝脏毒性的发生情况,并运用引物特异性PCR及PCR-RFLP方法检测TPMT*2,TPMT*3A,TPMT*3B,TPMT*3C四种TPMT突变等位基因,进一步对5例发生药物毒副作用的患者进行TPMT外显子测序,并分析AZA药物毒副作用与TPMT基因多态性之间的相关性。结果在对43例接受AZA治疗的IBD患者的随访中,观察到有4例患者发生了骨髓抑制,1例发生了肝脏毒性。而基因多态性检测发现该5例患者均不存在TPMT*2,*3A,*3B,*3C这4种常见的TPMT突变等位基因。进一步对该5例患者进行外显子测序工作,发现其中3例患者存在TPMT*1S突变杂合子,即7号外显子17772479 T→C突变,导致cDNA 474位T→C改变,但是编码的第158个氨基酸仍为异亮氨酸,没有发生改变,为无义突变。在第三部分对AZA治疗的IBD患者的基因多态性与药物毒副作用关系的研究中,我们发现AZA药物毒副作用无法完全通过TPMT基因突变来解释。而TPMT活性除基因多态性外,还受到其他多种因素例如未知突变、药物间相互作用的影响。那么在中国汉族IBD患者中是否可以直接通过TPMT活性检测来预测AZA的药物毒副作用,TPMT活性与AZA药物疗效的关系又如何呢?因此第四步,我们采用反相高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测红细胞内TPMT活性,初步探讨中国汉族IBD患者TPMT活性与AZA药物毒副作用及疗效的关系。以13例服用AZA治疗的IBD患者为研究对象,运用高效液相色谱法测定红细胞内TPMT的活性。结果发现发生早期骨髓抑制的3例患者TPMT平均活性低于没有发生骨髓抑制的患者(9.3±2.1 U/mlpRBC vs 18.0±6.2 U/ml pRBC;p=0.046),并且低于早期未发生骨髓抑制的患者组(9.3±2.1 U/ml pRBC vs 17.74±5.5 U/ml pRBC;p=0.029)。发生肝脏毒性的患者1例,TPMT活性为28.8 U/ml pRBC,明显高于没有发生肝脏毒性的患者(14.7±4.8U/ml pRBC)。其中有3例发生骨髓抑制的患者在AZA减量至50mg/d后能够耐受维持治疗。AZA治疗中维持缓解的IBD患者TPMT活性显著低于没有诱导缓解的患者(13.7±3.5 U/ml pRBC vs 22.0±5.5 U/ml pRBC;p=0.009)。以医院为基础的IBD患者治疗现状研究显示,部分IBD患者未得到理想治疗。尤其是对AZA类药物毒副作用的顾虑限制了免疫抑制剂的使用,降低了IBD的治疗质量,主要原因是临床缺乏相应的预测方法。在第二、三、四部分的研究中,我们建立了可靠的TPMT基因多态性及酶活性的检测方法。发现汉族IBD患者TPMT突变等位基因频率较低,且对发生药物毒副作用的患者进行TPMT外显子测序后未发现错义突变,TPMT基因突变并不能完全解释AZA药物毒副作用;而初步研究发现TPMT活性能较好的预测早期药物毒副作用的发生及治疗疗效,指导药物治疗剂量。因而TPMT多态性检测有助于筛选AZA药物毒副作用的高危患者,建立个体化治疗方案。
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