缺氧预处理骨髓间充质干细胞移植减轻糖尿病大鼠心肌凋亡并延缓心室重塑

论文摘要

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）是糖尿病病人在不伴有冠状动脉疾病,心脏瓣膜病和高血压病等的情况下出现的心功能不全,以早期的心肌舒张功能不全和晚期的收缩功能不全为特征。其病理表现为心肌微循环障碍,心肌细胞的凋亡和坏死及进行性的间质纤维化,导致心肌灌注异常,晚期可出现充血性心力衰竭。因此维持心肌的微循环稳态修复损伤心肌对于治疗DCM有一定价值。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种多能干细胞,在心肌微环境中可分化为心肌细胞和血管内皮细胞,同时它们可以释放促进血管生成和抗凋亡的因子,如血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）,肝细胞生长因子（hepatic growth factor,HGF）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF-1）等,从而激活内源性的修复机制。在缺血性心脏病和扩张性心肌病的大鼠模型中也发现,MSCs移植能够抑制心肌纤维化,降低基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2和MMP-9的表达。然而MSCs移植后的低存活力大大限制了细胞治疗的效果,而缺氧预处理（anoxicpreconditioning,AP）可以增加MSCs的存活力和其治疗心肌缺血损伤,减轻心肌凋亡和重塑的有效性。目前,对于MSCs在治疗DCM中的价值尚未有相关报道。我们猜想MSCs可以保护糖尿病心肌,而对MSCs进行缺氧预处理可以增强这种保护作用。研究方法7-8周的体重在160-180g的雄性SD大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）（60mg/kg）,24小时后血糖大于300mg/dl即认为糖尿病建模成功。之后每周检测血糖,血糖稳定8周后大鼠DCM模型建立成功。骨髓MSCs由冲洗雄性的8周SD大鼠的股骨和胫骨骨髓腔并用密度梯度离心法分离获取。3-5次传代后贴壁的梭形骨髓MSCs得到扩增和纯化。移植前采用流式细胞仪对骨髓MSCs进行检测。同时采用免疫荧光法检测MSCs VEGF的表达情况。MSCs在体外用细胞膜染料CM-DiI（2μg/ml）标记20分钟。AP-MSCs缺氧（氧浓度＜0.5%）3小时。糖尿病大鼠建模成功4个月后,糖尿病大鼠随机分别心肌注射150μL DMEM（n=10）,5×106MSCs/150μL（n=10）,或5×106 AP-MSCs/150μL（n=10）。每只大鼠按以下5个点进行心肌注射:右室游离壁,基底部和左室中前壁,侧壁和后壁。在糖尿病大鼠建模成功后2月、3月及MSCs移植后2周,我们采用心脏超声评价大鼠的心功能情况。并MSCs移植后2周,采用组织病理分析（毛细血管密度和纤维化面积）,对凋亡相关蛋白、生长因子和信号通路蛋白的western blot分析及对MMP-2活性的明胶酶谱分析来评价DMEM、MSC和AP-MSC三组糖尿病大鼠的心脏情况。结果1.糖尿病大鼠血糖升高,心功能下降糖尿病病程2月时,糖尿病大鼠的血糖明显高于对照组大鼠（520±12 vs 113±5mg/dl,p＜0.01）,而体重则明显低于对照组（274±9 vs 347±11g,p＜0.01）。糖尿病大鼠的左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness,LVPW）和短轴缩短率（fractional shortening,FS）明显低于对照组（LVPW:1.6±0.1 vs 1.8±0.1mm,p＜0.05;FS:38.7±1.2 vs 46.2±1.2%,p＜0.01）,左房内经（left atrialdimension,LAD）在糖尿病组略高,但未达到统计学差异。糖尿病病程3月时,随着糖尿病的进展,糖尿病组大鼠的LVPW和FS进一步下降（LVPW:1.1±0.1 vs1.85±0.1mm,p＜0.01;FS:32.9±2.3 vs 44.5±2.0%,p＜0.01）。由此可见,糖尿病病程2月时大鼠的心功能已明显低于对照组,而且随着糖尿病进展,糖尿病大鼠的心功能进一步恶化。2.MSCs的鉴定和移植后的体内追踪体外培养的3-5代的MSCs多数表达CD44及CD90,而CD45的表达为阴性,提示这些细胞为骨髓间充质干细胞来源。MSCs也表达VEGF。移植后3天,在糖尿病大鼠心肌内可见DiI标记的MSCs,表明心肌注射成功,并有MSCs在糖尿病心肌内定植。3.MSCs特别是AP-MSCs改善了糖尿病大鼠的心功能细胞移植后2周,三组大鼠仍然为高血糖。AP-MSC组的心脏/体重指数偏低（p＜0.01 vs DMEM组）,三组的室间隔厚度,左室舒张期内径和左室后壁厚度相当,但与DMEM组相比AP-MSC组的左室收缩期内经较小（p＜0.05）。DMEM、MSC和AP-MSC三组的FS分别为28.2±1.6%、34.9±1.4%和38.1±1.0%。MSCs移植,尤其是AP-MSC移植增加了糖尿病大鼠的FS（p＜0.01,p＜0.01）,改善了心功能。4、AP-MSCs增加了糖尿病大鼠心肌毛细血管密度,减轻了心肌纤维化碱性磷酸酶染色显示,AP-MSCs组毛细血管密度为2904±149/mm2,与DMEM组2210±86/mm2和MSC组2402±89/mm2相比,AP-MSC显著增加了糖尿病大鼠心肌的毛细血管密度（P＜0.01,P＜0.01）。Masson染色显示DMEM组较MSC组和AP-MSC组有着更为严重和广泛的心肌纤维化。与DMEM组（8.2±0.2%）相比,MSC组（7.4±0.2%）和AP-MSC组（6.7±0.2%）纤维化面积明显下降（p＜0.05,p＜0.01）。此外,AP-MSC组和MSC组MMP-2活性也升高,分别是DMEM组的1.94±0.17倍（p＜0.01）和1.31±0.07倍（无统计学差异）。5.AP-MSCs增加Bcl-2/Bax比值,减少caspase-3的激活MSCs移植后2周,DMEM、MSC和AP-MSC三组心肌的Bcl-2蛋白表达相当,AP-MSC组的Bax表达量偏低,但未达到统计学意义。然而与DMEM组相比,AP-MSC组Bcl-2/Bax比值升高（p＜0.05）。三组中caspase-3的表达相当,而AP-MSC组被剪切的具有活性的caspase-3表达低于DMEM和MSC组（p＜0.01,p＜0.01）。6、AP-MSCs降低了糖尿病心肌转化生长因子β-1表达移植后2周,三组的心肌VEGF蛋白表达未见明显差异。而AP-MSC组心肌转化生长因子（transforming growth factor,TGF）β-1表达低于DMEM和MSC组（p＜0.01,p＜0.01）。7、AP-MSCs诱导了糖尿病心肌AKT和ERK的磷酸化Western blot显示,移植后2周三组大鼠心肌总的Akt和ERK表达量相当,但糖尿病大鼠心肌的磷酸化Akt和磷酸化ERK水平在AP-MSC移植后明显上调,MSC组的磷酸化ERK水平也略有上调。结论AP-MSCs上调了大鼠糖尿病心肌Bcl-2/Bax比例并抑制caspase-3的表达和激活,从而减轻了心肌血管内皮细胞的凋亡而改善了心肌的微循环。同时AP-MSCs增加了糖尿病心肌MMP-2活性并抑制了TGFβ-1的表达,减轻了糖尿病心肌的纤维化。心肌内注射MSCs对糖尿病心肌病具有保护作用,对MSCs进行缺氧预处理可以增强这种保护作用。AP-MSCs可能是通过激活AKT和ERK通路来发挥抗凋亡及减轻心室重塑作用从而改善了糖尿病大鼠的心功能。

论文目录

• 一、缩略词表
• 二、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、正文
• 1:前言
• 2:材料与方法
• 3:结果
• 4:讨论
• 5:小结
• 6:参考文献
• 四、综述
• 综述一 干细胞移植治疗心力衰竭国内应用状况与评价
• 综述二 骨髓间充质干细胞的多向分化潜能
• 综述三 Multilineage Transdifferentiation of MSCs
• 五、附录
• 六、致谢