猪生长激素ELISA检测体系的建立和应用

论文摘要

猪生长激素（porcine growth hormone,pGH）又称猪促生长素（porcinesomatotropin,pST）,是由猪脑垂体前叶以脉冲方式分泌的约191个氨基酸的肽类激素,是调节猪正常生长和发育的主要激素之一。它能促进葡萄糖吸收、核酸与蛋白质的合成以及脂肪的分解,提高猪的生长速度,饲料报酬和瘦肉率。近年来随着杂交瘤技术的发展及pGH单克隆抗体的成功制备,为建立pGHELISA测定技术提供了可能。酶联免疫吸附测定法（ELISA）由于具有无放射性污染、特异性强、灵敏度高、测定周期短、对实验室条件要求不高等许多优点,因而受到人们的普遍关注和重视。灵敏的ELISA检测方法的建立,为开展猪生长发育及生殖的GH调控及GH基因转移和表达的研究提供了一种行之有效的GH检测手段,对内分泌学的研究进程具有重要意义和应用价值。本试验采用猪生长激素（pGH）免疫家兔制备了抗血清,经饱和硫酸铵粗提得到兔抗pGH的IgG抗体,SDS-PAGE鉴定抗体的纯度,紫外分光光度计测定蛋白含量达到21mg/mL;选取BALB/c小鼠,以猪生长激素纯品为抗原,进行免疫,脾细胞与sp2/0细胞融合筛选杂交瘤细胞。获得了三株稳定分泌猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤株,分别为1B4、1C4和2C5。和本课题组以前保存的其他三株单抗（1A3、1A5和1B5）同时进行效价、亲和力、Ig亚类及抗原识别位点等特性的鉴定,筛选出一株亲和力和效价都较好的单克隆抗体（1B4）。双抗体夹心法采用一株抗pGH的单克隆抗体（1B4）为包被抗体,以识别和结合待检标本中的pGH,兔抗pGH多抗可与pGH分子的另外表位结合,后加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的山羊抗兔IgG作为酶标抗体,并催化底物显色,根据标准品OD值绘制标准曲线,在标准曲线上查出待检标本中的pGH含量,成功地建立了pGH的双抗体夹心ELISA法。pGH含量在0.02μg/mL～2.0μg/mL范围内,浓度对数与其OD490nm值呈线性关系,绘制标准曲线。未知样品中pGH含量由标准品对照计算得出,最低检测限为50ng/mL。此方法具有快速、灵敏、特异的特点。在实际应用中分别测出60、120、180日龄的松辽黑猪血液中激素含量是0.601±0.012μg/mL、0.801±0.014μg/mL、0.924±0.022μg/mL。其中180日龄猪血液中生长激素含量与国内报道同日龄猪相符合。本研究意在利用猪生长激素纯品去免疫BALB/c小鼠,进而构建具有稳定分泌猪生长激素单抗的杂交瘤株,再利用猪生长激素单克隆抗体建立一种快速、灵敏、特异的检测猪血液及组织中生长激素的方法,进行品种间比较,为动物的品种选育提供参考指标,并为其早期育种提供依据,还可以为猪生长激素节律性分泌的机理研究奠定理论和物质基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第二章 猪生长激素标准检测曲线的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 松辽黑猪血液中PGH含量检测
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介