烟草根际铁载体产生菌ARDRA分析、铁载体拮抗活性研究及fur基因克隆

论文摘要

本研究对分离到的烟草根际铁载体产生菌进行了遗传多样性分析,从中筛选到一株限铁条件下对烟草疫霉有较好拮抗作用的地中海假单胞菌,研究了其铁载体对烟草疫霉的拮抗活性,克隆了其铁吸收调控蛋白基因,并用转座子诱变法获得了其铁载体合成缺失突变株,得出如下结论:1、用16S rDNA PCR扩增产物的限制性酶切分析（ARDRA）、16S rRNA序列同源性和进化树分析等方法,对从烟草根际分离到的299铁载体产生细菌进行了遗传多样性分析。这299个分离物分属于28个ARDRA类型,由测序结果进一步可知分属于β-,γ,α-变形杆菌、鞘氨醇杆菌、芽孢杆菌和放线菌纲的14个不同的属。尤其是由假单胞菌、肠杆菌、沙雷氏菌、泛菌、欧文氏菌和窄食单胞菌构成的γ-变形杆菌占据了18个ARDRA类型。研究结果展示了比以往研究更为丰富的铁载体产生细菌多样性,例如,首次报道了鞘氨醇杆菌G-2-21-1和G-2-27-2、Pseudomonas poae G-2-1-1、内共生肠产气杆菌G-2-10-2和N-5-10、食酸丛毛单胞菌G-1-15、木糖氧化无色杆菌N-46-11HH和N-5-20在限铁条件下产生铁载体。其中95%以上的铁载体产生菌属于革兰氏阴性菌,枯草芽孢杆菌和红平红球菌是仅有的两类革兰氏阳性菌。进一步研究发现,假单胞菌和肠杆菌占了产生铁载体总菌数的50%以上,还发现75%以上的产生高铁载体活性单位（4060）的细菌属于假单胞菌。2、从烟草根际筛选到一株限铁条件下烟草疫霉[Phytophthora parasitica var. nicotianae （Breda de Hann）Tucker]拮抗菌G-229-21T。该菌产生高亲和力铁载体。通过形态特征、生理生化实验、16S rRNA序列同源性和系统发育分析及种特异性分子法鉴定,确定其属于Pseudomonasmediterranea。XAD-2吸附层析法提取其铁载体,分光光度法检测其产生羧酸型铁载体。该铁载体,在低铁条件下（0.16μmol/L10μmol/L FeCl3）对烟草疫霉的抑制率达92.3%以上,而在富铁条件下（100μmol/L FeCl3）抑制率仅为2.0%。3、采用兼并引物PCR和TAIL-PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR）法,获得了完整的P. mediterranea G-229-21T铁吸收调控蛋白基因序列。该基因与Pseudomonas fluorescens PfO-1 fur基因的同源性最高为82%,其编码蛋白质含有104个氨基酸,与P. fluorescens PfO-1 Fur蛋白的同源性最高为86%。并通过Swiss-Model对其Fur蛋白空间结构进行了模拟。4、用抗生素平板法对P. mediterranea G-229-21T进行抗药性试验,G-229-21T对卡那霉素敏感,能够耐受20μg/mL以上的氯霉素。利用转座子Tn5-1063a对G-229-21T进行转座子插入诱变,筛选出1株铁载体合成缺失突变株:G-229-21TA。用P. mediterranea特异性引物PC5/1和PC5/2,以突变株基因组为模板进行了特异性扩增,证实了突变株由出发菌株突变而来。根据转座子Tn5-1063a上luxA序列,设计引物,分别以G-229-21T总DNA、pRL1063a DNA和突变株总DNA进行PCR扩增,测序结果表明,突变株G-229-21TA的luxA序列与已知的luxA序列同源性为100%,由此证实转座子Tn5-1063插入到G-229-21T基因组中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 细菌遗传多样性研究进展
• 1.2.1 传统的微生物培养法
• 1.2.2 PLFA 分析法
• 1.2.3 DNA 中mol % G+C 丰度的分析
• 1.2.4 核酸探针检测技术
• 1.2.5 DNA 复性动力学研究
• 1.2.6 基于PCR 技术的分子标记技术
• 1.3 烟草根际和叶际微生物多样性研究
• 1.4 微生物铁载体研究进展
• 1.4.1 微生物铁载体的种类与结构
• 1.4.2 铁载体的提取和纯化
• 1.4.3 铁载体检测方法
• 1.4.4 微生物铁载体的合成及相关基因
• 1.4.5 PGPR 与铁载体
• 1.5 铁吸收调控蛋白-Fur
• 1.5.1 E. coli 中fur 基因的调节
• 1.5.2 其它细菌中的Fur
• 1.6 转座子诱变法基因克隆策略研究进展
• 1.6.1 细菌转座子的插入机制和随机诱变作用
• 1.6.2 转座子标签技术
• 1.7 本研究的立题依据、研究内容和技术路线
• 1.7.1 立题依据
• 1.7.2 研究内容
• 1.7.3 技术路线
• 第二章 烟草根际铁载体产生菌ARDRA 分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 土样
• 2.1.2 培养基、试剂与仪器
• 2.1.3 细菌的分离
• 2.1.4 铁载体产生菌的筛选
• 2.1.5 基因组DNA 的提取
• 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.7 PCR 扩增体系和条件
• 2.1.8 参考菌株的模拟酶切
• 2.1.9 铁载体产生菌的ARDRA 分析
• 2.1.10 16S rRNA 基因测序和序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 细菌的分离
• 2.2.2 铁载体产生菌的筛选
• 2.2.3 参考菌株的ARDRA 分析
• 2.2.4 铁载体产生菌的ARDRA 和16S rRNA 基因序列分析
• 2.2.5 铁载体产生菌分布分析
• 2.3 讨论
• 第三章 Pseudomonas mediterranea G-229-21T 筛选、鉴定及其铁载体拮抗活性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂和仪器
• 3.1.4 菌株的分离和筛选
• 3.1.5 铁载体的定性检测和定量分析
• 3.1.6 菌株的鉴定
• 3.1.7 铁载体的制备
• 3.1.8 铁载体类型的检测
• 3.1.9 铁载体对烟草疫霉的抑制作用
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 菌株的筛选
• 3.2.2 铁载体的定性检测和定量分析
• 3.2.3 菌株的鉴定
• 3.2.4 铁载体的制备和类型的检测
• 3.2.5 铁载体对烟草疫霉的拮抗作用
• 3.3 讨论
• 第四章 P.mediterranea G-229-21T铁吸收调控蛋白基因克隆与Fur结构模拟
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株和载体
• 4.1.2 培养基及主要试剂
• 4.1.3 细菌基因组DNA 提取
• 4.1.4 fur 保守区域的克隆和序列测定
• 4.1.5 fur 完整基因的克隆
• 4.1.6 fur 序列分析和系统发育分析
• 4.1.7 Fur 序列分析及结构模拟
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 fur 保守区域的克隆
• 4.2.2 完整 fur 基因的克隆
• 4.2.3 P. mediterranea 的 fur 基因的核苷酸序列
• 4.2.4 P. mediterranea 的 fur 基因编码的 Fur 序列分析
• 4.2.5 Fur 结构模拟
• 4.3 讨论
• 第五章 P.mediterranea G-229-21T 铁载体缺失突变株筛选
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 培养基及抗生素
• 5.1.3 试剂及仪器
• 5.1.4 抗药性试验
• 5.1.5 铁载体检测
• 5.1.6 转座子诱变
• 5.1.7 铁载体合成能力变化突变株的复筛
• 5.1.8 基因组DNA 的提取
• 5.1.9 琼脂糖凝胶电泳
• 5.1.10 DNA 凝胶回收
• 5.1.11 DNA 浓度的确定
• 5.1.12 DH5α感受态制备
• 5.1.13 特异性引物扩增验证
• 5.1.14 luxA 扩增和测序验证
• 5.2 结果
• 5.2.1 铁载体合成缺失突变株的筛选
• 5.2.2 突变株总基因组提取
• 5.2.3 特异性引物扩增验证
• 5.2.4 luxA PCR 扩增和测序验证
• 5.3 讨论
• 第六章 结论和建议
• 6.1 结论
• 6.2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况