雷斯青霉15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮工艺研究

论文摘要

孕二烯酮（gestodene）（17a-Ethinyl-17β-hydroxy-18-methyl-4,5-estradien-3-one）是最新一代的孕激素之一。它以原形直接与孕激素受体结合,在临床上与炔雌醇组成复合片或三相片作为短效口服避孕药。目前合成孕二烯酮主要采用化学方法合成路线,这种方法需要昂贵的Pb（OAc）2和Bu3SnOMe,成本较高。与有机合成方法相比,生物催化反应具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性,易于纯化,环境污染性小,且有利于提高转化率,降低成本。本文采用微生物转化技术,利用Penicillium raistrickii（ATCC 10490）催化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮的15α位羟基化反应,得到合成孕二烯酮的重要中间体——15α-羟基左旋乙基甾烯双酮,具体内容如下。发酵液中主要成分的测定方法的建立。用薄层层析法,以石油醚：乙酸乙酯=1：2（v／v）作为展开剂,可以定性地分析底物和产物。同时建立了高效液相色谱分析法,采用外标法用于准确定量测定底物和产物,初步研究了该分析方法的实验条件、重复性及准确性等。正常细胞15a-羟基化左旋乙基甾烯双酮转化体系的建立,对其微生物转化工艺进行了优化。得出最佳培养基组分（g/L）为：葡萄糖30,玉米浆20,NaNO32, KH2PO41, K2 HPO42, MgSO40.5, FeSO40.02, KC10.5;最适转化条件为接种量10%,初始pH7.5,摇瓶装量50mL,转化温度28℃,投料浓度0.2%,投料时间30h,转化时间60h,底物添加方式为底物超声粉碎后加4%甲醇和1.5%tween80溶解。在此条件下,摇瓶转化率可达70%以上。雷斯青霉原生质体转化体系的建立。对雷斯青霉的原生质体制备及其对甾体的15α羟基化反应进行了初步的研究。用0.6%的溶壁酶和0.6%蜗牛酶、0.6mol/LNaCl为渗透稳定剂,温度30℃、pH6.5、菌龄18h,可以从所试的菌丝体得到浓度为2.0×105／mL的原生质体。青霉原生质体的甾体转化反应体系为：1)原生质体细胞浓度106／mL；2)反应液成分：0.2mol／L的磷酸缓冲液（pH6.5）,内含渗稳剂0.6mol／L甘露醇溶液；3)装液量5mL／50mL；4)投料浓度0.05%；5)转化温度28℃,摇床转速150r／min; 6)转化周期36h。与菌丝体转化相比转化率提高了1.15倍,转化速度增快了1.55倍。发酵罐放大试验及工艺优化。优化后得出：种龄2lh；接种量5%；pH值控制：0-27h为pH 7.5,27-66h为pH 6；溶氧控制：0-27h为溶氧40%,27-66h溶氧20%；细胞培养时间30h,转化42h,发酵罐转化率可达65%以上,为药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的进一步扩大发酵转化以及工业化生产奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 前言
• 1.1 甾体化合物
• 1.2 甾体化学的发展
• 1.3 甾体药物
• 1.4 微生物转化研究进程
• 1.5 甾体微生物转化反应类型
• 1.5.1 微生物转化甾体的主要类型
• 1.5.2 几种重要的甾体微生物转化反应
• 1.6 用于甾体类药物微生物转化的新技术
• 1.6.1 固定化细胞转化技术
• 1.6.2 原生质体转化技术
• 1.6.3 双水相转化技术
• 1.6.4 混合培养转化技术
• 1.6.5 顺序发酵
• 1.6.6 超临界流体技术
• 1.6.7 有机介质中甾体激素药物的微生物转化
• 1.6.8 磁化水处理
• 1.6.9 超声处理
• 1.7 孕二烯酮的合成研究
• 1.8 本文的研究内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 转化方法
• 2.2.3 制备及分析方法
• 3. 结果与讨论
• 3.1 分析方法的建立
• 3.1.1 底物左旋乙基甾烯双酮与产物15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的特征吸收峰检测
• 3.1.2 薄层层析法（TLC）的建立
• 3.1.3 高效液相色谱法（HPLC）的建立
• 3.2 正常细胞转化体系的建立
• 3.2.1 雷斯青霉的生长及转化
• 3.2.2 摇瓶转化的培养条件优化
• 3.3 雷斯青霉原生质体转化体系的建立
• 3.3.1 原生质体的制备
• 3.3.2 雷斯青霉原生质体甾体转化体系的建立
• 3.3.3 原生质体的甾体转化反应与正常细胞转化的比较
• 3.4 发酵罐放大试验
• 3.4.1 种龄的影响
• 3.4.2 接种量的选择
• 3.4.3 初始pH值的影响
• 3.4.4 溶氧的影响
• 3.4.5 投料及转化时间的确定
• 3.4.6 7L罐分批发酵过程曲线
• 4. 结论
• 5. 展望
• 6. 参考文献
• 7. 论文发表情况
• 8. 致谢