对转染NOR1基因的肝癌HepG2细胞信号转导的探讨

论文摘要

目的:为探索NOR1基因在肝癌发病机制、信号转导中的作用,用cDNA微阵列技术分析利用脂质体技术转染了NOR1基因的HepG2细胞基因表达谱的改变。用RT-PCR、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹技术对微阵列显示上调基因进行验证,综合本室实验结果和signaltransduction数据库数据绘制NOR1涉及的信号转导。方法:1用cDNA微阵列技术分析利用脂质体技术转染了NOR1基因的肝癌HepG2细胞基因表达谱的改变。2用RT-PCR、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹的技术对上调表达基因生长因子受体结合蛋白2、成纤维生长因子结合蛋白1、骨保护素结果进行验证。3综合本室实验结果并根据加拿大signal transduction studio信号转导数据库数据分析NOR1基因涉及的信号转导。结果:1 cDNA微阵列技术结果显示:NOR1基因的转染能使生长因子受体结合蛋白2（Grb2）,成纤维生长因子结合蛋白1（HBP17）,骨保护素（TNFRSF11B）等59个基因上调;同时也下调Bik,MAP2K6,锌指蛋白95（ZFP95）等103个基因。结果提示NOR1基因对肝癌HepG2细胞的生物学行为的影响可能与它对细胞信号转导,细胞周期调控,转录、翻译调控相关基因的表达影响有关。2 RT-PCR技术和蛋白质免疫印迹技术结果显示生长因子受体蛋白2（Grb2）表达上调,与微阵列结果相符。用实时荧光定量PCR对cDNA微阵列结果进行验证,结果显示pcDNA3.1（+）NOR1/HepG2中Grb2,HBP17,TNFRSF11B基因较pcDNA3.1（+）/HepG2上调了2.34,3.14,6.79倍;较HepG2细胞这三个基因则分别上调了4.87,5.23,6.33倍。结果与微阵列结果相符。3综合本室实验结果并根据加拿大signal transduction studio信号转导数据库数据本室粗略绘制了NOR1基因涉及的信号转导。结论:1 cDNA微阵列结果显示59个基因上调,103个基因下调。NOR1基因作为一个候选抑癌/易感基因转染肝癌细胞HepG2后,引起HepG2细胞基因表达谱广泛改变,这些差异表达基因包括:与凋亡或肿瘤相关基因,酶活性调控基因,细胞周期调控基因,信号转导活性基因,转录活性调控基因及翻译活性调控基因等。2用RT-PCR、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹技术考证微阵列显示上调基因生长因子受体结合蛋白2、成纤维生长因子结合蛋白1、骨保护素结果,结果与微阵列结果相符。3综合signal transduction studio和本室实验数据,本课题组粗略完成了有关NOR1基因参与的信号转导网络的绘制。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 英文缩略词表
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器与设备
• 2.1.2 细胞系
• 2.1.3 相关试剂
• 2.1.4 相关试剂配制
• 2.1.5 RT-PCR引物
• 2.1.6 实时荧光定量PCR引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 细胞培养
• 1基因转染'>2.2.3 NOR₁基因转染
• 1克隆筛选及鉴定'>2.2.4 NOR₁克隆筛选及鉴定
• 2.2.5 cDNA微阵列筛选差异表达基因
• 2.2.6 cDNA微阵列结果验证
• 第三章 结果
• 3.1 HepG2细胞总RNA提取结果
• 1基因阳性克隆鉴定'>3.2 NOR₁基因阳性克隆鉴定
• 3.3 cDNA微阵列结果
• 3.3.1 细胞总RNA提取结果
• 3.3.2 微阵列质量控制
• 3.3.3 双色荧光标记叠加图
• 3.3.4 杂交信号散点图
• 3.3.5 差异基因
• 3.4 微阵列结果验证
• 3.4.1 RT-PCR检测Grb2 mRNA表达
• 3.4.2 Western Blot检测Grb2蛋白表达
• 3.4.3 实时荧光定量PCR检测Grb2、HBP17、TNFRSF11B表达
• 第四章 讨论
• 1基因结构及相关研究'>1.NOR₁基因结构及相关研究
• 1对有联结蛋白参与的信号传导的影响'>2 NOR₁对有联结蛋白参与的信号传导的影响
• 1对凋亡、黏附等相关蛋白参与的信号传导的影响'>3.NOR₁对凋亡、黏附等相关蛋白参与的信号传导的影响
• 1对细胞周期的影响'>4.NOR₁对细胞周期的影响
• 1参与的信号传导'>5.NOR₁参与的信号传导
• 第五章 结论
• 第六章 参考文献
• 第七章 综述
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文